Toll样受体2对角质形成细胞分泌IL8的影响

　　【摘要】 　　目的:观察白念珠菌刺激人角质形成细胞后IL8的变化以及Toll样受体2(Tolllike receptor 2，TLR2)对IL8分泌的影响，探讨角质形成细胞在皮肤免疫系统中的作用。方法：白念珠菌分别与抗TLR2抗体预处理前后的角质形成细胞孵育，ELISA方法检测不同时间培养上清液IL8的水平。结果：白念珠菌可引起IL8明显升高(P<0.01)，3h开始，至24h达到高峰;中和TLR2受体后，虽然引起IL8升高,但无统计学意义(P>0.05)。结论：白念珠菌可以刺激角质形成细胞分泌IL8，TLR2在角质形成细胞IL8表达中的作用尚难确定。

　　【关键词】 白念珠菌 Toll样受体2 IL 8 角质形成细胞 天然免疫

　　Effects of Tolllike Receptor2 on Interleukin8 Secretion of Keratinocytes HUANG Guangrong1, FAN Li1, DUAN Yingchun1, DUAN Dejian2* (1Department of Obstetrics and Gynecology,Renmin Hospital;2Department of Dermatovenereology,Taihe Hospital,Yunyang Medical College,Shiyan,Hubei 442000,China)

　　Abstract: Objective To observe the change of Interleukin8(IL8) in keratinocytes induced with Candida Albicans and the effect of Tolllike receptor2(TLR2) on IL8 secretion,to explore the role of keratinocytes in skin immune system. Methods Candida Albicans were cultured on keratinocytes treated before and after antiTLR2 monoantibody(mAb),respectively.The levels of IL8 in culture supernatant were determined with ELISA at different time points. Results The IL8 levels were significantly increased after induced with Candida Albicans(P<0.01),the significant increase was observed at 3 h and reached the peak at 24 h;the increase of IL8 levels had no significant difference after TLR2 was neutralized with antiTLR2 mAb(P>0.05). Conclusion The secretion of IL8 in keratinocytes could be induced with Candida albicans,the function of TLR2 is uncertain in expression of IL8 in keratinocytes.

　　Key words:Candida albicans;Tolllike receptor2;Interleukin8;Keratinocytes;Innate immunity

　　念珠菌在人体表面的分布广泛而常见，而白念珠菌是引起念珠菌病的主要致病菌种。在去除表皮的实验说明表皮角质形成细胞在抵抗念珠菌感染中起重要作用。皮肤粘膜念珠菌病常表现为病原菌寄生部位的角层下脓疱或角层内大量中性粒细胞聚集，但是否与细胞表达的趋化因子IL8有关，目前还不太清楚[1]。Toll样受体2(Tolllike receptor 2，TLR2)是表达于角质形成细胞并参与真菌产物识别的天然受体蛋白，其与IL8的关系亦研究不多，故本研究旨在探讨TLR2对角质形成细胞分泌IL8的影响。

　　1 材料和方法

　　1.1 主要试剂

　　鼠抗人TLR2 mAb(Santa Cruz公司)、IL8 ELISA检测试剂盒(R&D System公司)、Triton X-100(Bebco公司)、KC-SFM和DMEM培养基(GIBCO公司)、牛胶原酶(Roche公司)、分散酶Dispase Ⅰ(Roche公司)、鼠抗人CK(AE1/AE3)、即用型SP免疫组化试剂盒单克隆抗体、即用型DAB酶底物试剂盒(北京中山生物技术有限公司)。

　　1.2 角质形成细胞的原代培养

　　人角质形成细胞的分离、培养和鉴定参考文献[2]，具体过程如下：取儿童包皮环切术后的新鲜包皮，0.1%新洁尔灭溶液消毒，磷酸缓冲液(PBS)清洗后，剪去多余的皮下组织;标本剪成皮片后浸入1.5 U/mL 的Dispase溶液中冷消化18～24 h，分离表皮和真皮，弃皮下组织和消化液;0.25%胰蛋白酶/EDTA消化液处理表皮，过滤残渣，滤液离心后收集细胞;1%胎盼蓝检测细胞活力并计数;按4×104 /cm2 的细胞密度接种，当细胞长满皿底80%左右时，所得细胞直接用于实验或继续传代;培养细胞经CK的免疫组化染色方法鉴定;所有试验取5代以内的细胞。

　　1.3 白念珠菌(简称白念)的培养

　　白念标准株(ATCC 10231，中国医学科学院皮肤病研究所真菌室友情提供)接种于37 ℃沙堡液体培养基中振荡培养，试验用对数生长期真菌;一个克隆形成单位定义为一个真菌细胞。

　　1.4 刺激实验

　　实验分为2组，A组：将细胞接种于24孔培养板内，长满皿底80%左右时，直接加入白念活菌以及白念死菌(分别是细胞数的8倍)刺激角质形成细胞。B组：每孔加入鼠抗TLR2抗体20 μg/mL，孵育1 h，PBS洗涤，再分别加入上述刺激物，与角质形成细胞孵育1、3、6、12、24 h时，取培养上清液，离心(5 000 r/min×5 min)，-20 ℃保存备用。每个相同的刺激实验做3复孔，同时设置阴性对照(添加培养基)。按照IL8 ELISA检测试剂盒说明进行操作，BIORAD酶标仪测定样品490 nm波长的OD值。

　　1.6 统计分析

　　实验数据以SPSS 10.0软件进行统计学处理，数值以(x±s)表示，两组样本采用t检验，三组及三组以上样本之间的两两比较采用ANOVA检验。

　　2 结果

　　表1 中和前后实验组与对照组IL8浓度比较注：与对照组比较，*P<0.05

　　如表1所示，白念活菌刺激角质形成细胞后IL8升高，3 h开始，达到(567.3±113.6) pg/mL，24 h为(1 079.9±236.6 )pg/mL，达到高峰，与对照组比较有统计学差异(P<0.01);而白念死菌刺激后，IL8仅有轻度升高，与对照组比较没有统计学差异(P>0.05)。用抗TLR2抗体中和TLR2作用后，白念死菌刺激组IL8升高不明显(P>0.05)，而白念珠菌活菌刺激组IL8仍明显升高(P<0.01)，但是TLR2抗体中和前后比较，IL8水平无统计学差异(P>0.05)。

　　3 讨论

　　皮肤是机体防御外部环境中有害物质入侵的第一道防线。作为表皮主要结构的角质形成细胞，除了构筑防御病原微生物入侵的物理性屏障外，还通过分泌细胞因子、趋化因子和抗菌肽，向其他细胞传递信号,引起中性粒细胞、淋巴细胞的趋化;加速表皮细胞增殖，从而调节皮肤炎症和免疫反应;并对入侵表皮的病原微生物有直接的杀伤作用，防止系统感染的出现。此外，紫外线、TL1、TL8、α黑素细胞刺激素(αMSH)可以增强角质形成细胞的杀白念珠菌活性;前列腺素E2(PG E2)、血小板活化因子(plateletactivating factor，PAF)也可能与杀伤作用有关[3]。

　　IL8来源于单核细胞、淋巴细胞、中性粒细胞、血管内皮细胞、角质形成细胞等，这些细胞正常情况下一般不产生或仅少量分泌，只有在受到适宜刺激如 TNFα、IFNγ、IL1、病毒感染、脂多糖等活化靶细胞才会引起IL8分泌增加。炎症反应中，细胞因子IL8促进中性粒细胞、淋巴细胞的趋化，使其表面黏附分子释放贮存酶，引起呼吸爆发，生成活性氧代谢产物，引发组织炎症损伤，是一种重要的趋化因子和致炎因子;其次，它还是角质形成细胞的促生长因子，可加速表皮增殖;还可以促进肿瘤生长、血管生成和癌细胞扩散。角质形成细胞通过分泌IL8等多种细胞因子调节皮肤炎症和免疫反应[4-6]。

　　本研究显示，用白念珠菌刺激角质形成细胞后，在没有巨噬细胞、中性粒细胞参与的情况下，IL8分泌增加。白念死菌仅能引起IL8的轻度升高，而白念活菌可以引起IL8显著升高。有研究表明，在皮肤粘膜炎症性疾病中IL8表达增多主要局限在炎症部位，银屑病的大部分病程中都有IL8的过度表达，并且认为这是引起表皮下Munro微脓肿的原因[7]。故推测念珠菌感染皮肤后，IL8升高可能是皮肤念珠菌病出现角层下中性粒细胞聚集和表皮增殖的重要原因。

　　机体对入侵病原微生物的识别是通过一系列模式识别受体(PRRs)介导的，PRR可以识别病原相关的分子模式(PAMPs)[7]，PAMPs是病原微生物某些共有的、结构高度保守的分子基序(Motifs)，包括酵母细胞壁上的甘露聚糖，各种细菌细胞壁成分脂多糖、多肽糖、胞壁酸，以及鞭毛蛋白、细菌DNA和病毒的双链RNA等。Toll样受体(TLRs)是与果蝇Toll蛋白家族结构高度同源、功能十分相似的一组天然受体蛋白，主要表达于哺乳动物细胞，在天然免疫中对入侵病原微生物的识别发挥重要作用。哺乳动物Toll样受体即是模式识别受体，目前已经发现细胞表面有十几种TLRs，其中大部分已找到相应的配基。不同的TLRs识别不同的微生物成分，如：TLR2能识别甘露聚糖、肽聚糖和胞壁酸等多种PAMPs;TLR3识别病毒双链RNA; TLR4可识别细菌的脂多糖;TLR5 识别细菌鞭毛蛋白;TLR7和TLR8能识别一些人工合成的抗病毒小分子;TLR9识别细菌CpG DNA等[8-13]。

　　TLR2是TLRs家族成员之一，很多方法已经证实TLR2抗体可以特异性地中和TLR2的功能[14-16]，当TLR2被中和后，白念活菌刺激细胞仍然引起IL8明显升高，也就是说，TLR2被中和前后，白念活菌引起的IL8升高没有明显的变化，推测角质形成细胞对白念珠菌的识别可能还有TLR2以外的其他途径。研究发现角质形成细胞表达的甘露糖结合受体参与白念珠菌珠菌及其胞壁成分的识别，并与IL8的分泌有关[3]。任何一种受体识别配体后均可引起IL8表达，这可能是抗TLR2抗体作用细胞后不能阻止IL8高表达的原因。

　　【参考文献】

　　[1]Sparmann A,BarSagi D.Rasinduced interleukin8 expression plays a critical role in tumor growth and angiogenesis[J].Cancer Cell,2004,6(5):447-458.

　　[2]段德鉴，蒋 献，冉玉平，等.白念珠菌对角质形成细胞β防御素2 mRNA表达的影响[J].中华皮肤科杂志,2005,38(4):202-204.

　　[3]Szolnoky G,BataCsorgo Z,Kenderessy AS,et al.A mannosebinding receptor is expressed on human keratinocytes and mediates killing of Candida albicans[J].J Invest Dermatol,2001,117(2):205-213.

　　[4]Mostefaoui Y,Bart C,Frenette M,et al.Candida albicans and Streptococcus salivarius modulate IL6,IL8,and TNFalpha expression and secretion by engineered human oral mucosa cells[J].Cell Microbiol,2004,6(11):1 085-1 096.

　　[5]Liboni K,Li N,Neu J.Mechanism of glutaminemediated amelioration of lipopolysaccharideinduced IL8 production in Caco2 cells[J].Cytokine,2004,26(2):57-65.

　　[6]Cummings R,Zhao Y,Jacoby D,et al.Protein kinase Cdelta mediates lysophosphatidic acidinduced NFkappa B activation and interleukin8 secretion in human bronchial epithelial cells[J].J Biol Chem,2004,279(39):41 085-41 094.

　　[7]Pivarcsi A,Kemény L,Dobozy A.Innate immune functions of the keratinocytes[J].Acta Microbiol Immunol Hung,2004,51(3):303-310.

　　[8]Pivarcsi A,Bodai L,Réthi B,et al.Expression and function of Tolllike receptors 2 and 4 in human keratinocytes[J].Int Immunol 2003,15(6):721-730.

　　[9]Alexopoulou L,Holt AC,Medzhitov R,et al.Recognition of doublestranded RNA and activation of NFkB by tolllike receptor 3[J].Nature,2001,413(6 857):732-738.

　　[10]Jurk M, Heil F,Vollmer J,et al.Human TLR7 or TLR8 independently confer responsiveness to the antiviral compound R848[J].Nat Immunol,2002,3(6):499.

　　[11]Büchau AS,Schauber J,Hultsch T,et al.Pimecrolimus enhances TLR2/6induced expression of antimicrobial peptides in keratinocytes[J].J Invest Dermatol,2008,128(11):2 646-2 654.

　　[12]Mishra BB,Gundra UM,Teale JM.Expression and distribution of Tolllike receptors 1113 in the brain during murine neurocysticercosis[J].J Neuroinflammation,2008,5:53.

　　[13]Ishii A,Matsuo A,Sawa H,et al.Lamprey TLRs with properties distinct from those of the variable lymphocyte receptors[J].J Immunol,2007,178(1):397-406.

　　[14]Netea MG,Brown GD,Kullberg BJ,et al.An integrated model of the recognition of Candida albicans by the innate immune system[J].Nat Rev Microbiol,2008,6(1):67-78.

　　[15]Netea MG,Ferwerda G,van der Graaf CA,et al.Recognition of fungal pathogens by tolllike receptors[J].Curr Pharm Des,2006,12(32):4 195-4 201.

　　[16]Gil ML,Fradelizi D,Gozalbo D.TLR2:for or against Candida albicans? [J]Trends Microbiol,2005,13(7):298-299;discussion:299-301.