腺病毒介导的p27mt基因转染对肝癌细胞及裸鼠移植瘤的生长抑制作用

　　【摘要】 　　目的：研究携带突变型p27的重组腺病毒(Adp27mt)基因转染对肝癌的体内、外抑制作用，并探讨其抑癌机制。方法：⑴将Adp27mt转染人肝癌细胞SMMC7721，Western blotting检测P27、Bcl2、Bax的表达;流式细胞仪(FCM)观察Adp27mt对肝癌细胞生长抑制作用。⑵Adp27mt直接注射入人肝癌裸鼠移植瘤中，绘制肿瘤生长曲线，计算肿瘤生长抑制率。结果：Adp27mt转染肝癌细胞后，细胞增殖明显受抑制，G0/G1期细胞比例增加，P27表达增强，Bax/Bcl2比例增高,采用Adp27mt基因治疗肝癌裸鼠移植瘤生长受抑制，肿瘤生长抑制率达57.09%。结论：Adp27mt基因转染对肝癌具有较显著的体内、外抑制作用和诱导凋亡作用，其机制是通过增强P27表达，使细胞产生周期阻滞,诱导凋亡的机理可能是上调Bax/Bcl2比例所引起。

　　【关键词】 p27mt 基因治疗 肝癌 裸鼠移植瘤

　　Inhibitory Effect of recombinant p27mt Adenovirus on Hepatic Carcinoma Cells and Transplanted Tumor in Nude Mice YU Yang1,2，CHEN Xianxiang1,3,WANG Guobin1，HE Zhijun3,WANG Jianing4,YANG Jianye4 (1Department of Laparoscopic Surgery，Xiehe Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan,Hubei 430022;2Anorectal Surgical Department,3Department of Hepatobiliary Surgery,4Institute of Clinical Medicine,Renmin Hospital,Yunyang Medical College,Shiyan,Hubei 442000,China)

　　Abstract：Objective To investigate the inhibitory effect of Adp27mt on hepatic carcinoma in vitro and in vivo and its possible mechanism.Methods ⑴Hepatic carcinoma cells SMMC7721 were infected with Adp27mt, the expression of P27,Bcl2,Bax were determined with Western blot.The Inhibitory effects of Adp27mt on the growth of hepatic carcinoma cells were evaluated with flow cytometry.⑵The therapeutic effects were evaluated with growth curves after injection of Adp27mt into transplanted tumor in nude mice,and caculated the inhibitory rates of tumor growth.Results After infected with Adp27mt,the proliferation of SMMC7721 cells was markedly inhibited.The proportion of cells at G0/G1 phase was increased,the expression of P27 and Bax/Bcl2 protein ratio were increased significantly.The growth of tumors in gene therapy with p27mt were obviously inhibited,the inhibitory rate of tumor growth was up to 57.09%.Conclusion p27mt gene transfer mediated by adenovirus vector has significant inhibitory effect and inducing apoptosis on hepatic carcinoma in vivo and in vitro,its mechanism may be the upregulation of p27mt expression that cause the carcinoma cell cycle arrest,the apoptosis induction may be the upregulation of bax/Bcl2.

　　Key words：p27mt;Gene therapy;Hepatic carcinoma;Transplanted tumor in nude mice

　　原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是一种世界性的常见恶性肿瘤，死亡率高，预后极差。目前认为HCC的发生主要由肿瘤细胞凋亡障碍和细胞异常增殖所产生，所以调控细胞增殖和凋亡成为其治疗研究的一个新热点，p27作为一种近年新发现的可负调控细胞周期的抑癌基因，正日益引起人们广泛的关注。

　　人p27基因具有负调控细胞周期进程、参与细胞分化的调控、诱导细胞凋亡等作用。由于p27基因具有抑癌作用而大多数肿瘤皆存在p27基因低表达，其被作为目的基因广泛运用于肿瘤的治疗研究。有学者针对P27蛋白的降解途径对p27基因进行修饰，使其编码的第187位氨基酸(苏氨酸)突变为蛋氨酸或丙氨酸，由此产生的突变型p27基因(mutanttype p27 gene,p27mt)编码产生的蛋白抗降解、更稳定，具有比野生型p27基因(wildtype p27gene,p27wt)更强的抑制肿瘤细胞生长和诱导凋亡活性。我们通过应用重组腺病毒将187位突变的p27基因(Adp27mt)导入人肝癌细胞以及直接注射入人肝癌裸鼠移植瘤中，研究Adp27mt基因转染对肝癌的体内、外抑制作用，并进一步探讨了可能的抑癌机制。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　SPF级BALB/c裸鼠购自湖北省实验动物中心[合格证号：SCXK(鄂2003-205)]，雌雄兼用，肝癌SMMC7721细胞(中国科学院上海细胞研究所),人源性鼠抗p27 单克隆抗体和人源性兔抗Bax多克隆抗体、人源性鼠抗Bcl2 多克隆抗体、碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG、碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司),重组腺病毒载体Adp27mt和腺病毒对照载体AdLacZ分别由郧阳医学院消化内科徐少勇教授和心血管内科王家宁教授惠赠。独立送回风动物饲养笼具(IVC笼具，苏杭动物实验器材公司)，二氧化碳培养箱(Binder，德国)，倒置相差显微镜(Olympus，日本)，流式细胞仪(Coulter EPICS XL，美国Beckman Coulter)，液体闪烁计数仪(TRICARB 2900TR，美国)，高速冷冻离心机(Hettich Universal 32R，德国)，超速冷冻离心机(Hitachi，日本)，紫外分光光度计(752型，上海)，水浴摇床(HZSH,哈尔滨)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养、转染、收集:人肝癌细胞株SMMC7721在37 ℃、5%CO2培养箱中，用含10%FCS的RPMI 1640培养基常规培养，密度达40%～50%时将Adp27mt和AdLacZ均按100 感染复数(MOI)转染肝癌细胞。将处于对数期生长的SMMC7721肝癌细胞消化脱壁,离心洗涤2次，调整细胞浓度，将细胞悬浮于PBS中备用。

　　1.2.2 动物模型建立：每只裸鼠予10%活力碘消毒皮肤，在裸鼠左颈部皮下接SMMC7721肝癌移植瘤细胞0.2 mL，含活细胞数约为1×107，常规饲养。每天观察皮下移植瘤的生长情况。至第5天，肿瘤生长至直径约0.7 cm，取其中大小较为均匀的21只随机分成3组，每组7只：⑴Adp27mt组:Adp27mt 0.1 mL(含腺病毒1×1010pfu)瘤内注射;⑵AdLac Z组:AdLac Z 0.1 mL (含腺病毒1×1010pfu)瘤内注射;⑶对照组:0.1 mL PBS瘤内注射。每组每2天注射一次，共3次。

　　1.2.3 腺病毒转导效率测定：用重组腺病毒AdLacZ，按25、50、100、200感染复数MOI感染SMMC7721细胞，Xgal染色后显微镜下观察蓝染的细胞即Lac Z基因表达的阳性细胞，分别计算蓝染细胞的百分率。

　　1.2.4 Western blotting分析检测P27、 Bax、Bcl2蛋白的表达：取Adp27mt和AdLac Z转染组及对照组48 h后的细胞，用1×PBS洗3次后,细胞裂解液4 ℃裂解30 min,超声碎裂30 s,13 000 r/min,离心去细胞碎片,留含有全蛋白的上清液，用BCA assay reagent测定蛋白浓度,50 μg蛋白与加样缓冲液混合,100 ℃变性5 min,在10%不连续SDSPAGE胶中电泳分离,电转染至硝酸纤维膜与一抗孵育12 h,相应二抗孵育1 h,用ECL发光法显色、曝光、显影、定影、水洗。

　　1.2.5 流式细胞仪检测细胞周期:6孔培养板，每组2孔。肝癌细胞制成5×104/mL细胞悬液，按3 mL/孔将SMMC7721细胞接种于6孔培养板，培养24 h后同步化。Adp27mt 、AdLac Z各按MOI=100转染SMMC7721细胞，继续培养48 h。用胰蛋白酶消化法收集细胞，固定24 h。加入200 μL RnaseA(100 mg/L)。37 ℃水浴30 min。加入800 μL碘化丙啶(PI)染色液混匀，4 ℃避光30 min。应用流式细胞仪检测，结果通过计算机处理分析各参数，得出细胞周期。

　　1.2.6 肿瘤的观察和测量：每二天用游标卡尺测量肿瘤的最长径(a)和最短径(b)，根据公式V=1/6πab2计算体积[1]，3周后断颈椎处死动物，剥离肿瘤，称质量并绘制肿瘤生长曲线，肿瘤生长抑制率(%)=(对照组肿瘤质量-实验组肿瘤质量)/对照组肿瘤质量×100%。

　　1.3 统计学处理

　　采用SPSS 13.0软件包，所得到的数值以均数±标准差(x±s)表示，组间差异采取t检验进行统计处理，其余数据用χ2检验。P﹤0.05认为差异具有显著性意义，P﹤0.01认为差异非常显著。

　　2 结果

　　2.1 Adp27mt的滴度及转染效率

　　重组腺病毒经繁殖、扩增、纯化后经紫外分光光度计测定，病毒滴度为1.32×1012CFU/mL， AdLacZ滴度为1.06×1012CFU/mL。在MOI≥50时，即可达到100%的转染效率,见图1。

　　2.2 Western blotting结果

　　P27蛋白在Adp27mt组高表达，AdLacZ组和空白对照组则仅能检测出低水平的P27 蛋白表达,见图2。并且可以发现，随着P27的高表达，Bax/Bcl2比例也逐渐增高。

　　2.3 p27mt对肝癌细胞细胞周期的影响

　　SMMC7721细胞经不同处理后检测细胞周期的结果如表1，AdLacZ组及对照组G1/G0期细胞比例逐渐下降，S期细胞比例上升，表明细胞周期G0/G1→S的转换过程非常迅速，细胞增殖活跃。而Adp27mt组G1/G0期细胞比例较高，S期细胞比例则下降，与对照组相比G1期比例差异有显著性(P<0.01)，表明细胞发生G1期阻滞，细胞增殖受到抑制。表1 Adp27对SMMC7721细胞周期的作用 注：与对照组比较，*P<0.01

　　2.4 Adp27mt对肝癌移植瘤生长的影响

　　建立模型后的第5天开始进行治疗。各个治疗组肿瘤体积均继续增大。但在治疗结束后Adp27mt组肿瘤生长逐渐减慢,2周后生长几乎停止;而AdLacZ组和对照组则生长较快(见表2,图3)。表2 Adp27mt对肿瘤体积的影响

　　2.5 肿瘤生长抑制率

　　Adp27mt组肿瘤生长明显受到抑制，瘤体质量为(1.87±0.15) g，显著低于AdLacZ组(4.15±0.53) g和对照组的(4.36±0.53) g(P<0.01)，肿瘤抑制率达57.09%;而AdLacZ组组和对照组比较则无明显差异(P>0.05)(见图4)。

　　3 讨论

　　原发性肝癌是一种临床常见、恶性度和死亡率较高的消化道肿瘤,目前主要以手术治疗为主。然而极大多数肝癌就诊时已失去治愈机会，能手术治疗的病人不足1/3，即使手术治疗仍有较高复发率。近年来，随着分子生物学理论和技术的发展，人们逐渐认识到，肝癌的发生是多因素、多阶段及多基因变异的综合病变过程。多种癌基因的活化和抑癌基因的失活可能是导致肝癌发生的重要原因[2]。利用基因工程技术，将目的基因导入基因突变或丢失的肝癌细胞中，代替原基因进行功能性表达，以恢复原基因功能和作用，纠正由于基因畸变或丢失而产生的细胞发育障碍可起到治疗作用。

　　p27基因是近年新发现的一种抑癌基因，其编码的P27蛋白为周期素依赖性蛋白激酶抑制因子(CDKI)，具有负调控细胞周期进程、参与细胞分化的调控、增强细胞间粘附、诱导细胞凋亡、抗炎症损伤等作用[3]。人的p27基因定位于第12号染色体短臂1区3带(12p13)，含有两个外显子及两个内含子，全长594 bp。其编码的p27蛋白含有198个氨基酸，分子量约为27 KD。P27蛋白的N末端28～87位氨基酸具有两个Ser磷酸化位点，介导CDK激酶活性的抑制，C末端有一个Thr磷酸化位点，与H1组蛋白磷酸化抑制作用有关。

　　p27属CDKI家族的Cip/Kip类，是细胞周期的负调控因子,能作用于整个细胞周期，广泛抑制各种周期素和CDK的活性，但主要抑制cyclinECDK2和cyclinDCDK4等激酶复合物活性,在细胞周期中有3个调控点,这3个调控点分别是G0/G1、G1/S、G2/M,其中G1/S和G2/M最为重要,细胞一旦通过G1/S这个关卡(checkpoint),它就进入DNA合成期，DNA一旦受到损伤且未得到正确修复,细胞就不能通过G2M关卡。其中cyclinECDK2是细胞通过G1/S限制点的关键，p27通过抑制cyclinECDK2使细胞停滞于G1期[4]。目前认为p27对CDK的抑制作用有两方面,一方面p27能抑制已结合到cyclin并被激活的CDK活性;另一方面p27也可以抑制CDK的激活过程,最终抑制细胞周期G1 →S 的转变,故认为其是一个肿瘤抑制因子。吴清明等[5]通过构建携带人p27kip1 cDNA的重组腺病毒(Adp27kip1基因)转移证实p27基因对食管癌具有较显著的体内、外抑制作用，其机制是增强P27表达、使细胞产生周期阻滞所引起。

　　以往研究表明，P27表达的下降在肝癌的发生发展过程中也普遍存在，Shehata MA等[6]提示P27可能抑制癌细胞的恶性变，并且认为P27在肝癌组织中的低水平表达与肝癌肿瘤的侵袭、进展、临床分期及细胞学分型有着显著的相关性。

　　但p27基因编码产生的P27蛋白半衰期较短且不稳定，因此，有学者[7]针对P27蛋白的降解途径对p27基因进行修饰，使其编码的第187位氨基酸(苏氨酸)突变为蛋氨酸或丙氨酸，结果发现突变型p27基因编码产生的蛋白抗降解、更稳定，具有比野生型p27基因更强的抑制肿瘤细胞生长和诱导凋亡活性。Park等[8]利用腺病毒载体表达p27，并观察其在肺癌细胞系的抗肿瘤效应，在几个细胞株中发现P27高表达并最终导致肿瘤细胞在G1、S期阻滞，在裸鼠毒可观察到肿瘤生长抑制，表明构建的p27腺病毒可作为目的基因用于肿瘤治疗。杜勇[9]等也证实，应用Adp27mt可以有效抑制大肠癌SW480细胞生长。

　　我们用Adp27mt转染人肝癌细胞株SMMC7721后发现，Adp27mt可有效介导p27mt基因转染使其在肝癌细胞SMMC7721中高表达。携带人突变p27基因的重组腺病毒对SMMC7721细胞的增殖有明显的抑制作用，并诱导G0/G1期阻滞，引起细胞凋亡。Adp27mt注入人肝癌裸鼠移植瘤中，肝癌裸鼠移植瘤生长明显受抑制，肿瘤生长抑制率达57.04%。但是其在G1/S期阻滞时如何具体诱导凋亡的机理还不十分清楚。目前认为凋亡通常发生在G1期，G1晚期或S期发生的细胞周期阻滞能加速或促进凋亡[10]，因此G1晚期表达的蛋白如p27 Kip1和p21 Cip1应该是凋亡调节的节点之一。 而在凋亡发生的整个进程中，目前认为线粒体是凋亡的枢纽，而且线粒体外膜上Bcl2家族蛋白参与的细胞凋亡分子调控起着非常重要的作用，包括拮抗凋亡的Bcl2, BclxL, Bclw,BAG,CED9,MCL1,A1,EIB19k和促进凋亡的BAX，BAK，BAD等[10]。Bcl2家族成员的一个显著特征是形成同源或异源二聚体，促进凋亡蛋白和拮抗凋亡蛋白的比率决定着细胞是否生存。

　　我们在检测P27表达量的同时，也检测了Bax/Bcl2蛋白，发现随着P27的高表达，Bax/Bcl2比例也逐渐增高，这也许能够解释p27诱导细胞凋亡是通过线粒体途径进行的。但是，具体的机理尚需要大量其他的实验来验证。以上结果为肝癌的基因治疗提供了新的思路，也为我们进一步探讨p27mt基因抑制肝癌肿瘤生长及促凋亡作用的机制提供了新的依据。下一步我们准备通过研究p27与凋亡蛋白相互的作用机制来探讨其促凋亡作用的机制与其它抑癌基因和癌基因的相互联系等，从而探索出一条新的有效治疗途径，最终改善肝癌治疗效果。

　　【参考文献】

　　[1]郑 红，王 琳，李静芳.裸鼠皮下人肝癌移植瘤模型的建立[J].昆明医学院学报,2003，24(3)：39-41.

　　[2]Martin J,Dufour JF.Tumor suppressor and hepatocellular carcinoma[J].World J Gastroenterol,2008,14(11):1 720-1 733.

　　[3]Matsuda Y.Molecular mechanism underlying the functional loss of cyclindependent kinase inhibitors p16 and p27 in hepatocellular carcinoma[J].World J Gastroenterol,2008,14(11):1 734-1 740.

　　[4]Zhang W,Bergamaschi D,Jin B,et al.Posttranslational modifications of p27kip1 determine its binding specificity to different cyclins and cyclindependent kinases in vivo[J].Blood,2005,105(9):3 691-3 698.

　　[5]吴清明， 张卫国， 童 强，等.腺病毒介导的p27kip1基因转移对食管癌细胞及裸鼠移植瘤生长的抑制作用[J].郧阳医学院学报,2004,23(5)：257-261.

　　[6]Shehata MA,Nosseir HR,Nagy HM,et al.Cyclin dependent kinase "inhibitor p27(kip1)" expression and subcellular localization in relation to cell proliferation in hepatocellualr carcinoma[J].Egypt J Immunol,2006,13(1):115-130.

　　[7]Hurteau JA,Brutkiewicz SA,Wang Q,et al.Overexpression of a stabilized mutant form of the cyclindependent kinase inhibitor p27(Kip1) inhibits cell growth[J].Gynecol Oncol,2002,86(1):19-23.

　　[8]Park KH,Seol JY,Kim TY，et al.An adenovirus expressing mutant p27 showedmore potent antitumor effects then adenovirusp27 wild type[J].Cancer Res，2001，61(16)：6 163-6 169.

　　[9]杜 勇,徐少勇,杨建业,等.突变型p27基因治疗裸鼠大肠癌移植瘤的研究[J].郧阳医学院学报,2006,25(3):143-146.

　　[10]Nemec KN, Khaled AR.Therapeutic modulation of apoptosis:targeting the BCL2 family at the interface of the mitochondrial membrane[J].Yonsei Med J,2008,49(5):689-697.