pET15bYARAEGFP原核表达质粒的构建及融合蛋白YARAEGFP的表达与纯化

　　【摘要】 　　目的：构建原核表达载体pET15bYARAEGFP，并进行YARAEGFP融合蛋白的表达和纯化。方法：用分子克隆技术构建出表达型载体pET15bYARAEGFP，在E.coli BL21(DE3)中表达融合蛋白YARAEGFP，并进行Ni2+NTA树脂柱亲和层析以纯化蛋白。结果：经测序证实成功构建了表达型载体pET15bYARAEGFP，YARAEGFP融合蛋白在E.coli BL21(DE3)中得到表达，纯化后的蛋白浓度为1.098 mg/mL。SDSPAGE和Western blot分析表明纯化蛋白为目的蛋白YARAEGFP。结论：已成功制备出YARAEGFP融合蛋白。

　　【关键词】 细胞穿透肽 增强型绿色荧光蛋白 原核表达 融合蛋白

　　Construction of Prokaryotic Expression Plasmid pET15bYARAEGFP and Expression and Purification of YARAEGFP Fusion Protein CHEN Sisi1,2,WANG Jianing2*,HUANG Yongzhang2,GUO Lingyun2,ZHENG Fei2 (1Cardiovascular Research Institute，Renmin Hospital,Wuhan University,Wuhan,Hubei 430060;2Institute of Clinical Medicine,Renmin Hospital,Yunyang Medical College,Shiyan,Hubei 442000,China)

　　Abstract:Objective To construct the expression vector pET15bYARAEGFP and express and purify the fusion protein YARAEGFP.Methods Two oligonucleotides encoding YARA were synthesized and annealed to generate YARAencoding DNA. The recombinant plasmid pET15bYARAEGFP was constructed by inserting YARAencoding DNA into pET15bEGFP. The fusion protein YARAEGFP induced with IPTG in E.coli BL21(DE3)was purified with Ni2+resin affinity chromatography and confirmed with SDSPAGE and western blot.Results Sequence analysis confirmed successful construction of the expression vector pET15bYARAEGFP,the fusion protein YARAEGFP was expressed and purified and its concentration was 1.098 mg/mL.SDSPAGE and Western blot demonstrated the fusion protein was YARAEGFP.Conclusion YARAEGFP fusion protein is successfully prepared.

　　Key words:Cell penetrating peptides;Enhanced green fluorescent protein;Prokaryotic expression;Fusion protein

　　自人类基因组计划的完成和蛋白组计划的实施以来，人们发现了许多生物大分子具有潜在的治疗价值。但细胞膜是脂质双分子层，具有选择通透性，这种天然屏障作用在保护细胞的同时也限制了生物大分子自由进入细胞内发挥作用。传统的将大分子物质转导入细胞内的常用方法有电穿孔、脂质体转染等，这些方法不但转导效率低，而且对转导的细胞均有毒副作用，且仅适用于体外实验。最近研究发现，某些蛋白质的结构区域具有将外源性蛋白转导入细胞内的特性，这些区域被称为蛋白转导结构域或细胞穿透肽[1]，它能携带有治疗作用的蛋白质转导入细胞内并发挥相应的生物学效应，这使它有可能成为一种理想的蛋白转导载体。目前研究最为深入的是来源于人类免疫缺陷病毒反式激活因子的TAT蛋白转导结构域，其氨基酸序列为YGRKKRRQRRR。Choi领导的研究小组[2-8]已经证实了TATGFP、TATGDH、TATSOD和TATCAT等融合蛋白能转导入哺乳动物细胞内和皮肤组织。为了进一步提高细胞穿透肽的转导效率，Ho等[9]将TAT的氨基酸序列进行优化，合成了一种新的蛋白转导结构域即YARA，其氨基酸序列为YARAAARQARA，发现其转导效率为TAT的33倍。为了探讨YARA介导的融合蛋白的离体和在体转导能力，本研究设计合成了编码YARA的DNA序列，通过基因重组技术构建了原核表达质粒pET15bYARAEGFP，表达并纯化出YARAEGFP融合蛋白，为YARA介导的生物大分子EGFP穿透细胞能力的研究奠定了基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 主要试剂:限制性核酸内切酶XhoⅠ、NdeⅠ、XbaⅠ和T DNA连接酶购自北京赛百盛基因技术有限公司;编码YARA的两条寡核苷酸链由北京赛百盛基因技术有限公司合成，序列为正义链：5′TATGTATGCCCGCGCGGCGGCGCGACAAGCGCGAG CCC3′(38 bp)，反义链：5′TCGAGGGCTCGCGCTTGTCGCGCCGCCGCGCGGGCATACA3′(40 bp)，100 bp DNA Ladder购自北京华美生物工程有限公司;IPTG(isopropyl βDthiogalactoside)购自美国Promega公司;Ni2+NTA 树脂填料购自美国QIAGEN公司;预染蛋白质相对分子量标准购自江苏碧云天有限公司;兔抗Histag多克隆抗体购自Santa Cruz公司;Western blot试剂盒购自美国KPL公司;ECL化学发光试剂盒购自Amersham Pharmacia Biotech公司。

　　1.1.2 质粒与菌株:pET15b,E.coli BL21(DE3)购自美国Novagen公司，E.coli DH5α和pET15bPEP1EGFP原核表达载体由郧阳医学院附属人民医院临床医学研究所提供。

　　1.1.3 主要仪器:投射式紫外分析仪(EF90A，上海)，凝胶成像系统(Touching 955 gel document system，上海)，台式高速冷冻离心机(Hettich，Universal 32 R，德国)，超声波细胞粉碎仪(JY983D，宁波)，超速冷冻离心机(Hitachi，Himac CP80MX，日本)，核酸蛋白检测仪(HD2004B，上海)，恒流泵(HL2，上海)，紫外分光光度计(Cecil 2041，英国)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 pET15bYARAEGFP的构建:将pET15bPEP1EGFP分别用XhoⅠ、NdeⅠ酶切，使之去掉编码PEP1的DNA序列，酶切产物用1%低熔点琼脂糖凝胶电泳，然后在紫外灯下切取含酶切大片段的凝胶，65 ℃水浴10 min融化凝胶，用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，沉淀用10 μL消毒三蒸水溶解。将编码YARA的两条寡核苷酸链等摩尔混合后煮沸变性，再逐渐降温至室温复性，形成两端分别为XhoⅠ和NdeⅠ粘性末端的双链DNA，然后与线性化的酶切大片段用T4 DNA连接酶连接。连接产物转化感受态DH5α大肠杆菌，扩增后提取重组质粒并用XhoⅠ和XbaⅠ酶切鉴定，若出现137 bp片段，说明编码YARA的DNA片段插入到酶切后的质粒中，成功插入了编码YARA序列的质粒命名为pET15bYARAEGFP(图1)。将重组正确的质粒送北京华大中生科技有限公司进行DNA测序。

　　1.2.2 pET15bYARAEGFP转化E.coli BL21(DE3)和YARAEGFP融合蛋白的诱导表达:从-80 ℃超低温冰箱取出100 μL E.coli BL21(DE3)，取1 μL pET15bYARAEGFP质粒加入菌液中，轻弹管壁，使其均匀分布，置冰上30 min，42 ℃水浴中热休克90 s后，迅速置冰浴冷却2 min。取1 mL SOC培养基与转化菌液混匀后加入10 mL离心管，将其置37 ℃水浴摇床中振摇(150 r/min)1 h。转化的菌液铺于含100 μg/mL Ampicillin的LB平板上，置37 ℃细菌培养箱中过夜，挑取单克隆接种于5 mL LB液体培养基中，37 ℃振摇培养过夜，然后用新鲜培养基按1∶50比例稀释，扩大培养至OD600≈0.8时加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG，30 ℃培养12 h以诱导目的蛋白的表达。4 ℃、5 000 r/min离心5 min，收集细菌沉淀，1×PBS漂洗3次，加6倍柱体积的结合缓冲液(5 mmol/L Imidazole，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris·HCl，pH 7.9)重悬菌体。然后冰浴超声破菌(520 W，30 min)，将菌液置超速冷冻离心机中20 000 r/min离心10 min，则融合蛋白以天然、可溶的形式存在于上清中。

　　1.2.3 YARAEGFP融合蛋白的纯化:pET15b作为载体所表达的基因工程重组蛋白在其N端带有一个由6个组氨酸组成的“标签”(Histag)，可用Ni2+NTA树脂进行亲和层析纯化。收集超离后的上清，将其转入装有Ni2+NTA树脂的层析柱中，静置4 h，以便6个组氨酸标签与填料中Ni2+充分结合。用10倍柱体积的漂洗缓冲液(30 mmol/L Imidazole，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris·HCl，pH 7.9)过柱以洗去未结合的杂蛋白，然后用5倍柱体积的洗脱缓冲液(500 mmol/L Imidazole，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris·HCl，pH 7.9)洗柱并收集洗脱下来的目的蛋白YARAEGFP。目的蛋白用生物半透膜透析48 h以充分脱盐(透析液为 pH 7.4的 PBS)，透析后的融合蛋白用0.45 μm的滤膜除菌后，用1.5 mL Eppendorf 管分装，-20 ℃保存备用。

　　1.2.4 YARAEGFP融合蛋白的定性：制备12%分离胶和5%浓缩胶，分别取含有目的蛋白的细菌裂解上清(纯化前)和收集的峰值洗脱液(纯化后)行SDSPAGE 电泳，凝胶用考马斯亮蓝R250 染色40 min后，用SDSPAGE凝胶脱色液放在水平摇床上振摇脱色至本底无色为止。融合蛋白经SDSPAGE分离后行Western blot以进一步证实纯化产物。将凝胶电转印至硝酸纤维素膜上，加10 mL封闭液封闭2 h阻断非特异性结合部位，加入1∶1 000稀释的一抗(兔抗组氨酸多克隆抗体)10 μL， 室温振摇孵育过夜。Western blot漂洗液漂洗4次，每次8 min。加10 mL封闭液及按1∶1 000 稀释的羊抗兔二抗10 μL，水平摇床孵育2 h 后漂洗4次，每次8 min。用三蒸水冲洗一遍硝酸纤维素膜，放入干净的平皿中加入1 mL化学发光剂ECL，置入暗室用X光胶片曝光，然后显影，定影。

　　1.2.5 YARAEGFP融合蛋白的定量：用Bradford法[10]对纯化蛋白进行定量，以标准牛血清蛋白作为标准对照。取考马斯亮蓝G250染液2 mL装入石英管中，在595 nm处用紫外分光光度计调零，然后加入10 μL标准牛血清蛋白(1 mg/mL)，再取一只石英管加入2 mL考马斯亮蓝G250染液和透析后的YARAEGFP蛋白10 μL，混匀，分别用紫外分光光度计在595 nm下测定两种蛋白的吸光值。融合蛋白YARAEGFP浓度(mg/mL)=(测定样品在595 nm处的OD值/标准牛血清蛋白在595 nm处的OD值)×1 mg/mL。

　　2 结果

　　2.1 pET15bYARAEGFP重组质粒的构建

　　构建的pET15bYARAEGFP经XhoⅠ和XbaⅠ双酶切，阳性克隆含有长度约137 bp和6 428 bp的两条带(图2)，说明YARA编码序列成功地插入到酶切大片段的XhoⅠ和NdeⅠ位点。

　　2.2 pET15bYARAEGFP重组质粒的测序

　　重组质粒pET15bYARAEGFP的测序结果显示编码YARA的DNA序列成功插入到酶切后的质粒中，编码YARA的DNA序列与人工合成的YARA编码序列完全一致(图3)。

　　2.3 YARAEGFP融合蛋白的定量

　　经Bradford法测定，纯化后的YARAEGFP蛋白浓度为1.098 mg/mL。

　　2.4 YARAEGFP融合蛋白的定性

　　考马斯亮蓝凝胶染色和Western blot结果显示YARAEGFP融合蛋白分子量约为29 kD(图4)，与预期的分子量相符。

　　3 讨论

　　细胞穿透肽(Cell penetrating peptides，CPPs)是一些通过非能量、非胞吞途径把蛋白质、肽段和DNA等大分子物质跨膜转导入细胞内的小于30个氨基酸的肽段[1]，CPPs能携带靶蛋白进入细胞内发挥生物效应。CPPs具有转运效率高、毒性低、体内外均可应用、对运载物质的大小无明显限制、无免疫原性，不引起炎症反应、且对进入细胞的物质的量可有效控制并使其保持在生理浓度范围等优点，而在物质运输领域得到广泛的应用。目前发现的CPPs主要有HIV1 反式激活因子的TAT、单纯疱疹病毒VP22、果蝇触角足蛋白同源结构域Antp以及人工设计的CPPs，如PEP1和YARA等。但TAT介导的蛋白转导需要融合蛋白在导入前进行变性，才能使融合蛋白进入细胞内。变性的TAT融合蛋白进入细胞内后，需HSP90家族成员将靶蛋白重折叠为天然有活性的构象，因此导入蛋白的生物活性依赖于HSP90分子伴侣的重折叠效率[11]。为了提高转导的蛋白进入细胞后的生物活性，需要设计一种新的转导肽将靶蛋白以一种天然有活性的结构形式转导入细胞内。Morris小组[12]设计合成了一个21个氨基酸的肽段载体PEP1，研究表明PEP1能把GFP、SOD、βGal、右旋糖苷、各种抗体等大分子物质转导进入多种哺乳动物细胞内[12-15]。董晓等[16-18]发现PEP1能有效携带目的蛋白EGFP穿透进入人血管平滑肌细胞、小鼠皮肤并分布于表皮和真皮，在体研究发现PEP1能介导EGFP转导入心、脑、肝、脾、肾组织内。

　　TAT有一个强的α螺旋结构，其有一面富含精氨酸残基，为进一步提高CPPs的转导效率，Ho等[9]在α螺旋的一面优化精氨酸残基的位置和用丙氨酸残基来替代部分氨基酸序列(丙氨酸具有最大的α螺旋稳定值)，以得到更加稳定的α螺旋结构的CPPs，即YARA，其序列为：YARAAARQARA。YARA在二级结构上是双亲结构，亲水部分可能有利于精氨酸上带正电的胍基与细胞表面结合，而疏水部分可能更加有利于穿透细胞膜。实验证明YARA能介导大分子物质转导入离体和在体的细胞内并且其转导能力较TAT有明显增强，其转导效率是TAT的33倍。

　　增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein，EGFP)是绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)的突变体[19]。GFP的分子量为27 kD，它的表达没有种属特异性，不需要辅助因子、底物或其他基因表达产物的协助作用，灵敏度高[20]。EGFP在480 nm波长的激发下可以发射出比GFP亮35倍的绿色荧光，使得其观察和检测更为准确。本研究采用的EGFP可以直接在荧光显微镜下对转导的活体细胞进行观察，观察后的细胞可继续用于后续的实验，为YARA介导的融合蛋白转导能力的研究提供了一种理想的目的蛋白。

　　本研究通过基因重组的方法构建出原核表达质粒pET15bYARAEGFP，转化大肠杆菌BL21(DE3)，然后用IPTG诱导表达出融合蛋白YARAEGFP。根据融合蛋白的N端带有6个组氨酸标签，利用镍柱金属螯合亲和层析，纯化出YARAEGFP。纯化后的蛋白可以用特异性的抗组氨酸“标签”抗体方便地进行检测。纯化蛋白的SDSPAGE电泳和Western blot结果显示YARAEGFP分子量约为29 kD，与预测的相符。本研究为观察YARA介导的EGFP在离体和在体的转导能力进而为利用YARA作为携带具有潜在治疗作用的蛋白质的载体研究奠定了基础。

　　【参考文献】

　　[1]Vivès E,Brodin P,Lebleu B.A truncated HIV1 Tat protein basic domain rapidly translocates through the plasma membrane and accumulates in the cell nucleus[J].J Biol Chem,1997,272(25):16 010-16 017.

　　[2]Gustafsson AB,Sayen MR,Williams SD,et al.TAT protein transduction into isolated perfused hearts:TATapoptosis repressor with caspase recruitment domain is cardioprotective[J].Circulation,2002,106(6):735-739.

　　[3]Ryu J,Han K,Park J,et al.Enhanced uptake of a heterologous protein with an HIV1 Tat protein transduction domains (PTD) at both termini[J].Mol Cells, 2003, 16(3): 385-391.

　　[4]Han K,Jeon MJ,Kim SH,et al.Efficient intracellular delivery of an exogenous protein GFP with genetically fused basic oligopeptides[J].Mol Cells,2001,12(2):267-271.

　　[5]Han K,Jeon MJ,Kim KA,et al.Efficient intracellular delivery of GFP by homeodomains of Drosophila Fushitarazu and Engrailed proteins[J].Mol Cells,2000,10(6):728-732.

　　[6]Yoon HY,Lee SH,Cho SW,et al.TATmediated delivery of human glutamate dehydrogenase into PC12 cells[J].Neurochem Int,2002,41(1):37-42.

　　[7]Kwon HY,Eum WS,Jang HW,et al.Transduction of Cu,Znsuperoxide dismutase mediated by an HIV1 Tat protein basic domain into mammalian cells[J].FEBS Lett,2000,485(2-3):163-167.

　　[8]Jin LH,Bahn JH,Eum WS,et al.Transduction of human catalase mediated by an HIV1 TAT protein basic domain and argininerich peptides into mammalian cells[J].Free Radic Biol Med,2001,31(11):1 509-1 519.

　　[9]Ho A,Schwarze SR,Mermelstein SJ,et al.Synthetic protein transduction domains:enhanced transduction potential in vitro and in vivo[J].Cancer Res,2001,61(2):474-477.

　　[10]Bradford MM.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of proteindye binding[J].Anal Biochem,1976,72:248-254.

　　[11]Schwarze SR, Hruska KA, Dowdy SF.Protein transduction: unrestricted delivery into all cells?[J].Trends Cell Biol,2000,10(7):290-295.

　　[12]Morris MC,Depollier J,Mery J,et al.A peptide carrier for the delivery of biologically active proteins into mammalian cells[J].Nat Biotechnol,2001,19(12):1 173-1 176.

　　[13]Eum WS,Kim DW,Hwang IK,et al.In vivo protein transduction: biologically active intact pep1superoxide dismutase fusion protein efficiently protects against ischemic insult[J].Free Radic Biol Med,2004,37(10):1 656-1 669.

　　[14]Henriques ST,Costa J,Castanho MA.Translocation of betagalactosidase mediated by the cellpenetrating peptide pep1 into lipid vesicles and human HeLa cells is driven by membrane electrostatic potential[J].Biochemistry,2005,44(30):10 189-10 198.

　　[15]Wu Y,Wood MD,Tao Y,et al.Direct delivery of bacterial avirulence proteins into resistant arabidopsis protoplasts leads to hypersensitive cell death[J].Plant J,2003,33(1):131-137.

　　[16]董 晓,王家宁,黄永章,等.PEP1介导增强型绿色荧光蛋白转导入人主动脉平滑肌细胞[J].郧阳医学院学报,2007,26(2):71-73.

　　[17]董 晓,王家宁,黄永章,等.细胞穿透肽PEP1介导增强型绿色荧光蛋白穿透在体小鼠皮肤[J].郧阳医学院学报,2007,26(5):265-267.

　　[18]董 晓,王家宁,黄永章,等.细胞穿透肽PEP1介导增强型绿色荧光蛋白在小鼠体内跨膜转导[J].基础医学与临床,2007,27(7):798-801.

　　[19]Zhang G,Gurtu V,Kain SR.An enhanced green fluorescent protein allows sensitive detection of gene transfer in mammalian cells[J].Biochem Biophys Res Commun,1996,227(3):707-711.

　　[20]KarRoy A,Dong W,Michael N,et al.Green fluorescence protein as a transcriptional reporter for the long terminal repeats of the human immunodeficiency virus type 1[J].J Virol Methods,2000,84(2):127-138.