L精氨酸减轻重症急性胰腺炎肺损伤的机制研究

作者：郑骁,刘国丽 作者单位：泰山医学院附属泰安医院，山东 泰安 271000

　　【摘要】 目的 研究L精氨酸(LArg)减轻急性出血坏死性胰腺炎(SAP)肺损伤的机制。 方法 采用逆行胰胆管注射牛磺胆酸钠(TAC)制造SAP模型，动物分为假手术组、SAP组、氯喹阻断组和LArg治疗组。计算肺组织学评分和肺损伤指数以评价肺损伤程度，荧光实时定量PCR方法检测肺组织TLR2/4 mRNA表达变化。结果 与假手术组(0.013±0.209E2, 0.110±0.742E2)比较，SAP组肺组织TLR2和TLR4 mRNA表达明显增高(1.045±1.741E2，2.067±1.914 E2，P<0.01)，肺损伤加重，肺组织TNFα浓度升高( P<0.05或P<0.01);氯喹阻断TLR2/4 mRNA表达后(0.478±7.412E2, 0.012±1.513 E3，P<0.01)，肺损伤程度减轻，肺组织TNFα浓度降低(P<0.05或P<0.01)。给予LArg治疗后，TLR2/4 mRNA表达降低(0.260±0.891E2，0.732±5.135 E2，P<0.01)，肺损伤程度减轻，肺组织TNFα浓度降低(P<0.05或P<0.01)。结论 SAP时，肺组织内TLR2和TLR4表达上调。肺组织内TLR2和TLR4的表达增高可能在SAP肺损伤的发生、发展中起重要的作用。LArg可以通过抑制TLR2/4表达从而减轻肺损伤。

　　【关键词】 Toll 样受体; 重症急性胰腺炎; 肺脏; 氯喹 ;L精氨酸

　　Mechanism of LArg relieving acute lung injury complicated in severe acute pancreatitisZHENG Xiao, LIU Guoli

　　(Taian City Central Hospital, Taian 271000, China)

　　Abstract:Objective: To investigate the mechanism of LArg relieving acute lung injury complicated in severe acute pancreatitis (SAP). Methods: Thirtytwo Wistar male rats were randomly divided into the shamoperated group(n=8), SAP group(n=8), Chloroquineinhibiteded group(n=8) and LArg treated group(n=8). The lung was dissected for lung histological scores and bronchoalveolar lavage was harvested for lung injury index. TLR2/4mRNA expression in the lung was measured by RTPCR. Results: TLR2/4 mRNA was detected in lung with low values in sthe hamoperated group(0.013±0.209E2, 0.110±0.742E2), but they were markedly increased in SAP (1.045±1.741E2, 2.067±1.914E2, P<0.01). Lung injury was aggravated, TNFαconcentration in lung was increased (P<0.05 or P<0.01). Treatment with CQ effectively inhibited TLR2/4mRNA expression(0.478±7.412E2, 0.012±1.513E3,P<0.01), TNFαconcentration was decreased and lung injury was relieved(P<0.05 or P<0.01). Treatment with LArg effectively inhibited TLR2/4mRNA expression(0.260±0.891E2, 0.732±5.135 E2, P<0.01) and relieved lung injury. e TNFα concentration was decreased. Conclusion: TLR2/4mRNA expression is increased in lungs in SAP. Upregulation of TLR2/4 mRNA expression in lung may be involved in the genesis and the development of lung injury complicated in SAP. LArg can markly inhibit TLR2/4mRNA expression in lung in SAP, which leads to relief of lung injury.

　　Key words:Tolllike receptor; severe acute pancreatitis; lung; chloroquine; LArginine

　　重症急性胰腺炎(SAP)是一种严重危害人类健康的常见疾病，可以发病早期引起心、肺、肾、肝等多器官功能不全。其中以急性肺损伤(ALI)最多见，其具体机制不详。研究提示AHNP的恶化和持续坏死与病程早期促炎症细胞因子(包括TNFα、IL6、iNos等)的过量释放有关[1]。本研究通过观察急性出血坏死性胰腺炎大鼠肺组织中TLR2/4 mRNA的表达变化，了解TLR2/4mRNA在AHNP肺损伤中的作用及L精氨酸对AHNP肺损伤的治疗作用的机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物与分组

　　Wistar大鼠32只(雄性，体重约为160—180 g)随机分为四组：假手术组(A组)、SAP组(B组)、CQ阻断组(C组)和LArg治疗组(D组)，每组8只。

　　1.2 动物模型的制备

　　实验前大鼠禁食8小时，自由进水。SAP采用逆行胰胆管牛磺胆酸钠(TAC,Sigma公司)注射制造动物模型，剂量为5%TAC 0.1 ml/100 g;CQ阻断组在SAP模型建立前1/2 h经腹腔注射CQ(Sigma公司，美国)，50 mg/kg;LArg治疗组在行SAP模型建立后经下腔静脉注射L精氨酸(凌飞科技公司，日本)，100 mg/kg;A组动物开腹后翻动肠管后关腹。于术后6小时剖杀动物，留取静脉血和肺组织标本待测。

　　1.3 观察指标与方法

　　(1)肺组织学检查：标本石蜡包埋，4 μm切片，HE染色。肺脏组织学评分按Osman等的标准计算[2]。 (2)肺损伤指数:肺灌洗后以灌洗液蛋白/血清总蛋白比值表示。(3)组织TLR2/4和TNFαmRNA的表达：以Trizol一步法提取细胞总RNA(Promega公司，香港)，荧光实时定量逆转录—聚合酶链反应(RTPCR)技术进行定量分析。

　　1.4 统计学处理

　　计量数据以均数±标准差表示,组间比较采用方差分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 肺组织的病理学改变和肺损伤指数

　　与A组相比，SAP组各时间点的肺损伤明显严重(P<0.01);CQ阻断组较SAP组肺损伤减轻，组织学评分降低(P>0.05)，肺损伤指数明显减低(P<0.01)。L精氨酸治疗组较SAP组肺损伤减轻(t：3.001—3.479;P<0.05或P<0.01)。见表1。表1 肺损伤情况注：▲与A组比较：P<0.05或P<0.01;★与胰腺炎组比较：P<0.05或P<0.01

　　2.2 血清淀粉酶和肺组织中NO及TNFα浓度变化

　　SAP组血清淀粉酶和肺组织内 TNFα浓度明显高于A组(P<0.01)。CQ阻断组血清淀粉酶和肺组织TNFα明显低于SAP组(P<0.05或 P<0.01)。L精氨酸治疗组肺组织TNFα明显低于胰腺炎组,但仍高于A组(P<0.01)。见表2。表2 血清淀粉酶和肺组织中NO及TNFα浓度变化注：▲与A组比较：P<0.05或P<0.01;★与胰腺炎组比较: P<0.05或P<0.01

　　2.3 肺组织中TLR2/4 mRNA的表达

　　TLR2/4 mRNA在A组有少量表达，SAP组较A组有明显升高(P<0.01);CQ可以明显阻断肺组织中TLR2/4 mRNA的表达(P<0.01)。L精氨酸对TLR2/4 mRNA的表达有明显的抑制作用(P<0.01)。见表3表3 肺组织TLR2/4 mRNA的表达 注：▲与A组比较：P<0.05或P<0.01;★与胰腺炎组比较：P<0.05或P<0.01

　　3 讨 论

　　TLRs通过识别保守的病原相关分子模式(PAMP)，在天然免疫反应中发挥着重要作用，同时参与特异性免疫应答的启动[3]。其中TLR2/4在细菌感染中效应最显著，TLR2可以识别革兰氏阳性菌的PAMP;TLR4可以识别革兰氏阴性菌和白色念珠菌的PAMP，从而在感染的发生发展中起作用[4]。有文献报道，氯喹可以抑制TLR4/9表达，减轻LPS和寡脱氧核苷酸(CpG ODN)的损害作用[5]。在本实验中应用氯喹作为TLRs的阻断剂，通过观察SAP肺损伤中TLR 2/4 mRNA表达的变化规律，有助于了解TLR2/4 mRNA表达在SAP肺损伤中的意义。

　　本实验结果显示：A组的大鼠肺组织中有少量的TLR2/4 mRNA表达。SAP组肺组织TLR2/4 mRNA表达明显增高，肺组织TNFα浓度升高，肺损伤加重(P<0.05或P<0.01);氯喹阻断TLR2/4 mRNA表达后，肺损伤程度减轻，肺组织TNFα浓度降低(P<0.05或P<0.01)。给予L精氨酸治疗后，TLR2/4 mRNA表达降低，肺损伤程度减轻，肺组织TNFα浓度降低(P<0.05或P<0.01)。由此推测：SAP时，肺组织TLR2/4基因的表达上调，诱导各种促炎症细胞因子的过量合成与释放，参与机体失控性炎症反应和多器官功能衰竭。当抑制其表达后，肺组织内促炎症细胞因子的合成与释放降低而导致肺损伤程度减轻。L精氨酸可以通过抑制TLR2/4基因的表达从而减轻肺损伤。TLR2/4 mRNA表达在急性出血坏死性胰腺炎肺损伤中可能起着十分重要的作用，而L精氨酸对SAP大鼠肺组织有明显的保护作用。

　　TLRs的表达在SAP肺损伤中是否是一种始动因素，以及TLR2/4 mRNA在SAP肺损伤中的具体激活机制和L精氨酸抑制TLR2/4 mRNA表达的机制，尚待进一步的研究。

　　【参考文献】

　　[1] Kingsnorth A. Role of cytokines and their inhibiters in acute pancreatitis[J]. Gut，1997，40: 14.

　　[2] Osman MO, Kristensen JU, Jacobsen NO, et al. A monoclonal antiinterleukin 8 antibody (WS4) inhibits cytokine response and acute lung injury in experimental severe acute necrotising pancreatitis in rabbits[J]. Gut，1998，43:232239.

　　[3] Tsuneyasu Kaisho, Shizuo Akira. Tolllike receptors as adjuvant receptors[J]. Biochimica Biophysica Acta，2002，1589:113.

　　[4] Mihai G, Netea, et al. Tolllike receptors as an escape mechanism from the host defense[J]. TRENDS in Microbiology，2004， 12:484489.

　　[5] Zhou H, Zheng J, Wang LX, et al. Chloroquine protects mice from challenge with CpG ODN and LPS by decreasing proinflammatory cytokine release[J]. International Immunopharmacology，2004，4: 223234.