牛膝多糖对小鼠免疫性肝损伤的保护作用基

作者：徐晓燕1 张志港2 辛晓明1 王 浩1 作者单位：1.泰山医学院药理学教研室，山东 泰安 271016; 2. 泰山医学院2004级药学本科，山东 泰安 271016)

　　【摘要】 目的 研究牛膝多糖对小鼠免疫性肝损伤的保护作用。方法 序贯注射卡介苗(BCG)和脂多糖(LPS)，诱导小鼠产生免疫性肝损伤模型。在造模过程中，小鼠每日ig 150、300 mg·kg1牛膝多糖，共10 d。比色法测定血清和肝组织中丙氨酸氨基转移酶(ALT )的含量，TBA法和NBT法测定肝匀浆中超氧歧化酶(SOD)的活力以及丙二醛(MDA)的浓度。并计算脾脏及胸腺重量指数。结果 ig 150、300 mg·kg1牛膝多糖后，可明显降低模型小鼠血清和肝组织中升高的ALT的水平，抑制肝匀浆中上升的MDA水平和升高过低的SOD活性，并降低脾脏及胸腺重量指数。结论 牛膝多糖对小鼠免疫性肝损伤有一定的保护作用。

　　【关键词】 牛膝多糖;免疫性肝损伤;抗氧化

　　The protection of achyranthesbidentata polysaccharideson immunological liver injury in miceXU Xiaoyan1, ZHANG Zhigang2, XIN Xiaoming1, WANG Hao1(1.Dept. of Pharmacology, Taishan Medical College, Taian 271000, China;2.Pharmaceutical Undergraduate of 2004,Taishan Medical College,Taian 271000, China)Abstract:Objective:The experiment was performed to study the achyranthesbidentata polysaccharides' effects on immunological liver injury in mice. Methods: An immunological liver injury model was induced by administration of lipopolysaaccharide following injection of BCG vaccine into mice for 10 days.ALT levels in serum and liver homogenates ，the activity of SOD and the concentration of MDA in liver homogenates were examined. Results: Ahyranthesbidentata polysaccharides could significantly lower the levels of ALT, MDA and spleen index and increase the activity of SOD. Conclusion: Achyranthesbidentata polysaccharides have protecting effects on immunological liver injury in mice.

　　Key words:achyranthesbidentata polysaccharides; immunological liver injury; antioxidation

　　牛膝(AchyranthesbidentataBL)又名百倍，鸡胶骨，为苋科多年生草本植物，根为药用部分，是我国的一种传统中药。其味苦、酸，性平，入肝肾经。中华人民共和国药典(2005年版)上记载：牛膝有补肝肾、强筋骨、逐瘀通经、引血下行之功效[1]。牛膝根含三萜皂甙、甾体类、糖类、氨基酸、生物碱类和香豆素类化合物等，其中多糖是其重要的活性成分之一，具有调节机体免疫功能、抗生物分子氧化等活性。本课题前期的研究表明，牛膝多糖对四氯化碳所致化学性肝损伤有一定保护作用，本实验进一步观察了牛膝多糖对BCG(卡介苗)+LPS(脂多糖)联合诱导小鼠产生免疫性肝损伤的影响。

　　1 材料和方法

　　1.1 药品与试剂

　　牛膝由泰山医学院药学院购进，经本院生药学教研室鉴定为怀牛膝;联苯双酯滴丸，德州德药制药公司，批号061005 ;无水乙醇，分析纯，天津市广成化学试剂有限公司，批号为080215;0.9%氯化钠注射液(normal NS)，山东省泰安制药厂，批号07033102;GPT、SOD、MDA试剂盒，南京建成生物工程研究所;卡介苗，上海生物制品研究所;脂多糖，Sigma公司产品。

　　1.2 仪器

　　BT815A自动生化测试分析系统，上海三科仪器有限公司;电子分析天平AR2140，奥豪斯(上海)公司;LXJIIB型低速大容量离心机，上海安亨科学仪器厂。

　　1.3 动物

　　昆明种小鼠，18～22 g，雌雄兼用，由泰山医学院动物实验中心提供。

　　1.4 方法

　　1.4.1 牛膝多糖的提取纯化和含量测定[2] 取粉碎至适当颗粒的牛膝药材40 g，置1000 ml容量瓶中加80%乙醇200 ml浸泡14 h，微沸回流脱脂2次，每次2 h。残渣滤干置1000 ml圆底烧瓶中按料液比1︰15加水600 ml，80℃，提取两次，每次3 h。合并两次提取的滤液，置旋转蒸发仪上浓缩至约100 ml。Savage试剂法脱蛋白，加入3倍的Savage试剂充分震荡混匀，5000 r/min离心15 min，取上清液重复脱蛋白操作2次，至不再出现蛋白。将所得溶液按1︰5加入无水乙醇进行醇沉，静置一夜，5000 r/min离心15 min，所得粉末用CCl4洗涤2次，乙醚洗涤2次，每次洗涤后离心。干燥的白色粉末即为牛膝多糖，用苯酚—硫酸法测定所提取牛膝多糖含量为74.28%。

　　1.4.2 动物分组与给药 取小鼠60只，雌雄各半，按性别和体重随机分为5组。①生理盐水对照组;②模型对照组;③联苯双酯150 mg·kg-1·d-1阳性对照组;④⑤分别为牛膝多糖150 mg·kg-1·d-1、300 mg·kg-1·d-1实验组。③组灌胃联苯双酯150 mg·kg-1·d-1，④⑤组分别灌胃牛膝多糖150 mg·kg-1·d-1、300 mg·kg-1·d-1，①②组分别灌胃等容量生理盐水，连续给药10天。参照文献[3]，制作小鼠免疫性肝损伤模型，即由尾静脉注射0.2 ml内含2.0 mg BCG的生理盐水溶液，10 d后每鼠尾静脉注射7.5 μg LPS。12 h后小鼠摘眼球取血，4000 r/min离心15 min分离血清，测定血清中ALT的含量。上述取血后处死小鼠剖取出肝脏、胸腺、脾脏。肝脏置生理盐水中洗净血液，拭干称取0.5 g用冷生理盐水制成10%肝匀浆，3500 r/min离心10 min，取上清测定ALT、 MDA、SOD的含量。胸腺、脾脏称其质量，计算脏器指数[脏器指数=脏器重(mg)/体重(g)]。

　　1.5 统计学处理

　　应用SPSS13.0统计分析软件处理数据。计量资料用均数±标准差(±s)表示。组间比较采用F检验。以P≤0.05为有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 牛膝多糖对免疫性肝损伤小鼠血清和肝组织中ALT的影响

　　由表1可见，与正常对照组比较，模型组小鼠血清和肝组织ALT显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)，说明造模成功。与模型组相比，牛膝多糖低剂量组与联苯双酯组小鼠血清和肝组织ALT均明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。表1 牛膝多糖对免疫性肝损伤小鼠血清和肝组织中ALT的影响注：与NS对照组比较：#P<0.05;与模型对照组比较：*P<0.05。

　　2.2 牛膝多糖对免疫性肝损伤小鼠肝组织MDA、SOD的影响

　　由表2可见，与正常对照组比较，模型组小鼠肝组织MDA水平明显升高， SOD水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比，低剂量牛膝多糖与联苯双酯能明显降低肝匀浆MDA的含量，提高SOD的水平，差异有统计学意义(P<0.05)。表2 牛膝多糖对免疫性肝损伤小鼠肝组织MDA、SOD的影响注：与NS对照组比较：#P<0.05;与模型对照组比较：*P<0.05。

　　2.3 牛膝多糖对免疫性肝损伤小鼠脾脏指数、胸腺指数的影响

　　由表3可见，与正常对照组比较，模型组小鼠脾脏、胸腺指数明显增加，差异有统计学意义(P<0.01，P<0.05)，表明BCG+LPS损伤后导致脾脏、胸腺增大。与模型组相比，低剂量牛膝多糖与联苯双酯能降低增大的脾脏、胸腺的质量指数，差异有统计学意义(P<0.05)。表3 牛膝多糖对免疫性肝损伤小鼠脾脏指数、胸腺指数的影响注：与NS对照组比较：##P<0.01，#P<0.05;与模型组比较：*P<0.05。

　　3 讨 论

　　目前，多数学者认为乙型肝炎病毒感染引起的肝损伤主要与机体免疫应答有关[4-5]，采用BCG+LPS诱导的免疫性肝损伤病理改变与肝细胞损伤机制均与乙型病毒性肝炎相类似。以BCG+LPS联合诱导小鼠制造免疫性肝损伤小鼠模型，较以往用化学物质造成的肝损伤模型在病理生理机制上更接近人体肝炎。给小鼠注射卡介苗可使巨噬细胞和中性多核粒细胞聚集于肝脏,使肝脏处于致敏状态，继而用低毒剂量的脂多糖攻击,可激发这些细胞释放TNFα等炎症因子,造成肝脏炎症、坏死[6]。

　　本实验模型组小鼠血清和肝组织ALT显著升高，肝细胞受到明显损伤，脾脏、胸腺质量指数增大，说明模型建立成功。低剂量牛膝多糖与联苯双酯均能降低肝损伤小鼠血清和肝匀浆中转氨酶的水平，降低增大的脾脏、胸腺的质量指数，提示牛膝多糖可明显减轻肝细胞损伤。MDA和SOD是反映脂质过氧化损伤的指标，可间接反应细胞内脂质过氧化损伤的程度。本实验结果发现，牛膝多糖低剂量可降低肝匀浆MDA的含量，使降低的SOD活性升高，表明牛膝多糖有一定的肝细胞膜结构和功能稳定作用，这可能与其清除自由基等抗氧化作用密切相关。实验发现，牛膝多糖高剂量表现一定的保肝、抗氧化的趋势，但多数缺乏统计学意义，具体原因尚需进一步研究。

　　以上研究提示，牛膝多糖可保护BCG+LPS联合诱导的免疫性肝损伤，其抗氧化作用可能是其保肝降酶作用的重要机制之一。

　　【参考文献】

　　[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].北京：化学工业出版社，2005：49，26.

　　[2] 汪茂田，谢培山，王忠东，等.天然有机化合物提取分离与结构鉴定[M].北京：化学工业出版社，2004：8.

　　[3] Nagai H,Yakuo I,Yamada H,et a1. Liver injury model in mice for immunopharmacological study [J]. Japan J Pharmacol, 1988, 46(3): 247254.

　　[4] 王华，魏伟，岳莉，等.白芍总苷对卡介苗加脂多糖引起的小鼠免疫性肝损伤的保护作用[J].中国药理学通报，2004，20(8)：875879.

　　[5] 熊筱娟，肖小华，徐丽英，等.乌索酸对小鼠急性免疫性肝损伤的影响[J].中成药，2005，27(11)：13521354.

　　[6] 商玉萍，方士英，葛金芳，等.虫草多糖对小鼠免疫性肝损伤的保护作用[J].华西药学杂志，2007，22(6)：654655.