皮炎湿疹患者外周血单个核细胞分泌Th1/Th2细胞因子水平检测及意义

　　作者：周淑英，刘玉峰，夏汝山，戚爱美

　　关键词: 皮炎，接触性;湿疹;单核细胞;Th1细胞，Th2细胞;淋巴细胞亚群;生物因子

　　摘 要:目的 探讨Th1/Th2细胞因子水平变化在皮炎湿疹发病机制中的作用. 方法 收集48例皮炎、湿疹患者外周血，用Ficoll-Hypaque分离单个核细胞，采用夹心ELISA方法检测单个核细胞培养上清中的细胞因子IFN-γ，(γ-干扰素)，IL-4(白细胞介素-4)，IL-10(白细胞介素). 结果 皮炎、湿疹组患者IFN-水平高于正常对照组(P<0.05)，其浓度(μg?L-1 )分别为67.7±27.3和65.2±29.9，对照组浓度(μg?L-1 )为15.9±8.2;IL-4水平低于正常对照组(P<0.05)，皮炎湿疹组浓度(μg?L-1 )分别为35.6±8.9和41.6±11.8，对照组浓度(μg?L-1 )为85.2±22.1;IL-10水平在两组间无显著差异，皮炎湿疹组浓度(μg?L-1 )分别为763.3±142.2和789.9±131.6，对照组浓度(μg?L-1 )为729.6±168.5. 结论 Th1型细胞因子在皮炎湿疹的发生发展中起重要的作用.

　　Investigation of PBMC┐secreted Th1/Th2cytokines in patients with dermatitis and eczema

　　ZHOU Shu-Ying，LIU Yu-Feng，XIA Ru-Shan，QI Ai-Mei

　　Center of Dermatology&Venereology of Chinese PLA，Xijing Hospital，Fourth Military Medical U-niversity，Xi'an710033，China，Rongjun Sanatori-um of Shandong Province，Taian271000，China

　　Keywords:dermatitis，contact;eczema;monocytes;Th1cells;Th2cells;lymphocyte subsets;biological factors

　　Abstract:AIM To study the role of IFN-γ，IL-4and IL-10cytokines in the process of dermatitis and eczema.METH┐ODS Peripheral blood of contact dermatitis and eczema pa-tients was collected and PBMC were separated with Ficoll-Hypaque，BA-ELISA was applied to detect cytokines IFN-γ，IL-4，IL-10from supernatants of PBMC culture.RESULTS Cytokines IFN-significantly increased in contact dermati-tis and eczema patients compared with normal controls(P<0.05)，the concentration(μg?L-1 )was67.7±27.3and65.2±29.9in contact dermatitis and eczema patients，and15.9±8.2in normal controls;while the level of cytokine IL-4was lower in patients(P<0.05)，the concentration(μg?L-1 )was35.6±8.9and41.6±11.8in contact dermatitis and eczema patients，and85.2±22.1in normal controls.However，there was no difference in the IL-10level between patients and normal controls，the concentration(μg?L-1 )was763.3±142.2and789.9±131.6in contact dermatitis and eczema patients，and729.6±168.5in normal controls.CONCLUSION Cytokines of Th1play an important role in the development of dermatitis and eczema.

　　引言

　　皮炎湿疹类皮肤病是皮肤科的常见病，其发病机制复杂且尚未完全阐明，目前的研究表明T辅助细胞(Th1/Th2)的动态平衡在接触过敏的发生发展中起重要作用.而Th亚群功能失衡引起细胞因子分泌紊乱在接触过敏的炎症发生发展中的作用研究最为深入，但观点并不一致.部分作者[1] 认为接触过敏性皮炎反应中浸润的淋巴细胞属于Th1型细胞，且发现皮损和外周血中都有-干扰素(IFN-)，白细胞介素-2(IL-2)的升高，而无Th2型细胞因子的升高;也有人认为Th2起主要作用[2，3] ;我们选择目前最受关注的IFN-γ，白介素-4(IL-4)，白介素-10(IL-10)，检测其在皮炎湿疹患者外周血中单核细胞分泌水平，进一步探讨接触过敏的发病机制，以寻求可能有效的治疗手段.

　　1 对象和方法

　　1.1 对象

　　西京医院皮肤科门诊患者30(男9，女21)例，均为接触性皮炎患者，平均年龄28岁(15～65岁);湿疹患者18(男12，女6)例均为西京医院皮肤科门诊患者，平均年龄32岁(13～60岁);健康对照组10例(男5，女5)，为西京医院工作人员，无皮炎湿疹等过敏性疾患，平均年龄25岁.

　　1.2 方法

　　1.2.1 PBMC采集

　　抽取患者及对照组的静脉血5mL，肝素抗凝，经Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，清洗后用含100mL?L-1 小牛血清的RPMI-1640调整细胞数至1×109 ?L-1 ，然后加入ConA诱导(0.05g?L-1 )，37℃50mL?L-1 CO2 孵箱中饱和湿度下培养48h后，离心，收集上清储存于-70℃冰箱待测.

　　1.2.2 夹心ELISA法检测细胞因子

　　检测培养上清中IL-4，IL-10及IFN-细胞因子.所用ELISA试剂盒购自深圳晶美公司，严格遵照试剂盒要求操作.

　　统计学处理:所得数据用统计软件SPSS8.0检验，两组间PBMC分泌Th1/Th2细胞因子水平有无显著性差异(t检验).

　　2 结果

　　接触性皮炎、湿疹患者及健康对照组分泌Th1/Th2细胞因子水平见Tab1，2.

　　表1 接触性皮炎患者PBMC培养上清中IFN-γ，IL-4，IL-10的浓度(略)

　　Tab1 Level of IFN-γ，IL-4and IL-10in supernatants of PBMC from patients with contact dermatitis

　　表2 湿疹患者PBMC培养上清中IFN-γ，IL-4和IL-10的浓度(略)

　　Tab2 Level of IFN-γ，IL-4and IL-10in supernatants of PBMC from patients with eczema

　　3 讨论

　　接触过敏反应是一种CD8+ T细胞介导的对表皮致敏半抗原的反应，产生IL-2，IFN-和TNF-β(β肿瘤坏死因子)等细胞因子的CD8+ T细胞(Th1)和产生IL-4，IL-5，IL-6，IL-10和IL-13等细胞因子的CD4+ T细胞(Th2)控制着该反应的严重程度和持续时间[4] .这些细胞因子积极参与各种生理及病理过程[5，6] .目前尚无区分Th1和Th2细胞的表面标志物，而血清、血浆或体液中细胞因子含量极微，难以客观反映它们的实际水平，因此目前对淋巴细胞产生细胞因子的功能方面的研究一般在体外进行，选用外周血单个核细胞(PBMC)体外培养上清作为一种替代体液的方法具有一定的优越性.

　　PBMC体外分泌细胞因子的能力与体内细胞因子治疗的预期效应相吻合[7] .本研究中，PBMC分泌的IFN-在接触性皮炎组和健康对照组、湿疹组与健康对照组之间有统计学意义(P<0.05)，说明皮炎湿疹患者Th1细胞亚群功能亢进.这与其皮损中Th1型细胞因子起主导作用[8] 是相符的，这是因为IFN-可促进表皮郎格罕细胞、角阮细胞HLA-DR及粘附分子的表达[9，10] .在免疫反应中，一些因子可能调控T细胞分化，Il-4刺激Th2分化，而IFN-，Il-12和TNF-β促进Th1细胞成熟[11] ，因此IFN-主要激活Th1细胞而抑制Th2细胞，反之，IL-4激活Th2细胞而抑制Th1细胞[12] ;本研究中，PBMC分泌IL-4水平在皮炎湿疹组明显低于健康对照组(P<0.05)，说明皮炎湿疹患者Th2亚群功能是降低的.IL-10是近年来发现的一种Th2分泌的细胞因子，因能抑制Th1细胞因子mRNA转录，故又称为细胞因子合成抑制因子[13] .研究中IL-10的水平在皮炎湿疹组与健康对照组无明显差异，与以往的研究有所不同[14] ，这可能是由于IL-10在疾病的不同阶段浓度有所差异，我们实验中所选择的患者皆为疾病的稳定期.在疾病的激发阶段及稳定阶段IL-10的水平是否有真正的差异，还有待于以后进一步研究.

　　细胞因子在第Ⅳ型变态反应的发生机制中起重要作用，所以检测细胞因子对变态反应的基础研究和临床应用都有重要的意义.有研究表明，抗角蛋白自身抗体对家兔接触性皮炎模型的修复，可能通过至少抑制细胞因子IL-6和IL-8的分泌而达到减轻炎症的作用[15] .我们在单个核细胞水平上测定细胞因子的产生，可以测定辅助性T细胞(Th)亚群，用于判断机体的免疫平衡状态[16] .通过对皮炎湿疹类皮肤病患者外周血单个核细胞分泌IFN-，IL-4，IL-10等细胞因子的测定，反映该类疾病Th1/Th2平衡状态，提示免疫功能异常是其发病的重要环节.因此检测机体Th1/Th2相关细胞因子，对认识疾病的发生发展规律及调整Th1/Th2平衡为目的，设计相应的治疗方案具有重要意义[17，18] .在治疗上可以检测结果采取一定的措施.根据上述结果，在皮炎湿疹的防治策略中，应重视对皮炎湿疹患者失衡的细胞因子进行矫正，如通过研制Th1/Th2功能平衡的药物，使其失衡的细胞因子网络恢复正常，对于防治长期反复发作的皮炎湿疹，提供一种新的思路.

　　参考文献:

　　[1]Kapsenber ML，Wierenga EA，Stiekema FEM，Tiggelman AM，Bos JD.Th1lymphokine production profile of nickel-spe-cific CD4+ lymphocyte clones from nickel contact allergic and non-allergic in dividuals [J].J Invest Dermatol，1992;98(1):59-62.

　　[2]Marcinkiewicz J，Chain BM.Regulation of in vitro release of the type cytokines(IL-4，IL-6)in the T cell response to the trini-tropheny1(TNP)hapten [J].Cell Immunol，1993;146(2):406-411.

　　[3]Riemann H，Schwarz A，Grabbe S，Kapp A.Neutralization of IL-12in vivo prevents induction of contact hypersensitivity and induces hapten-specific tolerance [J].J Immunol，1996;156(3):1799-1803.

　　[4]Xu H，Herger PS，Fairchild RL.Distinct roles for B7-1 and B7-2 determinants during priming of effector CD8+ Tc1and regula-tory CD4+ Th2cells for contact hypersensitity [J].J Im-munol，1997;159(9):4217-4226.

　　[5]Li T，Liu WY，Zhu HS.Serum cytokines in patients with multi-ple organ failure following open-heart-surgery [J].Di-si Junyi Daxue Xuebao(J Fourth Mil Med Univ)，2000;21(5):574-575.

　　[6]Zhang X，Chi SM，Li X，Fei Z，WH，Du L.Expression and se-cretion of interleukine-8in pituitary adenoma cells [J].Di-si Junyi Daxue Xuebao(J Fourth Mil Med Univ)，2000;21(9):1076-1078.

　　[7]Friberg D，Bryant J，Shannon W.In vitro cytokine production by normal human peripheral blood mononuclear cells as a mea-sure of immunocompetence or the state of activation [J].Clin Diagn Lab Immunol，1999;1(3):261-268.

　　[8]Bai YL，Zhang CL，Zeng LF，Xie ZQ.The researth on subtype of T cell on allergic contact dermatitis [J].Zhonghua Pifuke Zazhi(J Chin Dermatol)，1997;30(4):251-252.

　　[9]Griffiths CEA，Voorhees JJ，Nickoloff BJ.Characterization of ICAM-1and HLA-DR expression in normal and inflammated skin:Modulation by recombinant interferon gamma and tumor necrosis factor [J].J Am Acad Dermatol，1989;20(3):617.

　　[10]Chang CH，Furu M，Tamaki K.Selective regulation of ICAM-1and major histocompatibility complex classⅠandⅡmolecule expression on epidermal Langerhans cells by some of the cy-tokines released by keratinocytes and T cells [J].J Immunol，1994;24(6):2889.

　　[11]Sad S，Marcotte R，Mosmann TR.Cytokine-induced differenti-ation of precursor mouse CD8+ T cells into cytotoxic CD8+ T cells secreting Th1or Th2cytokines [J].Immunity，1995;2(3):271-279.

　　[12]Delpret EG，Maggi E，Romagnani S，Grabbe S.Human Th1and Th2cells functional properties，machenisms of regulation and role in diseases [J].Lab Invest，1997;70(3):229-231.

　　[13]Jin BQ.Cellular and molecular immunology [M].Beijing:Shi-jie Tushu Gongsi Chubanshe(World Stamp Company Publish-ing House)，1995:106-119.

　　[14]Kim JJ，Maguire HC Jr，Nottingham.Coadministration of IL-12or IL-10expression cassettes drives immune toward Th1phe-notype [J].J Interferon Cytokines Res，1998;18(7):537-547.

　　[15]Xia RS，Liu YF，Li CX，Dang YP，Wan YH，Lu T.Influence of homologuous antikeratin autoantibodies on serum IL-6and Il-8of rabbit model of contact dermatitis [J].Di-si Junyi Dax-ue Xuebao(J Fourth Mil Med Univ)，2001;22(15):1355-1357.

　　[16]Zhao W.The clinical significance and prospect of cytokine [J].Zhonghua Jianyanyixue Zazhi(J Chin Mea Med)，2000;23(4):199.

　　[17]Abbas AK，Murphy KM，Sher A.Functional diversity of helper T lymphocytes [J].Nature，1996;383(6603):787.

　　[18]Mosmann TR，Sad S.The expanding universe of T-cell Sub-sets:Th1，Th2and more [J].Immunol Today，