淋病奈瑟氏菌中国流行株gyrA和parC基因与喹诺酮类耐药性的相关性

作者：王胜春，刘玉峰，苏明权，王 强

　　关键词: 奈瑟氏球菌，淋病;药物耐受性;gyrA;parC

　　摘 要:目的 调查中国地区淋病奈瑟氏菌(NG)对喹诺酮类的耐药性状况，探讨高水平耐药的基因突变株对喹诺酮类耐药机制的作用. 方法 对9a来临床分离保存淋球菌流行株进行了体外环丙沙星(CIP)药敏实验.筛选出76株高水平CIP耐药株，通过PCR扩增了其中的18株NG的gyrA和parC喹诺酮耐药决定区基因，并对扩增子直接测序.通过NheI酶切、脉冲电场凝胶电泳(PFEG)分析了这些菌株的遗传关系. 结果 环丙沙星的耐药检出率有逐年增高的趋势，MIC≥1.0mg?L-1 的菌株由1993年的5.1%上升到2001年的21.4%.对照组中的18株敏感菌只有两株发生了gyrA的单一突变，未发现parC变异;而耐药组中89%(16)菌株的gyrA发生了Ser-91向Phe的单一突变株或(和)parC的双突变.88.9%(15)的菌株的gyrA发生了Ser-91向Phe和Asp-95向Gly的突变.在发生parC突变中72%属于Asp-86向Asn突变.PFEG分析发现10株具有完全一致的gyrA和parC突变模式.同时也发现来自不同地区的菌株的PFEG指纹图是不同的. 结论 研究表明，在中国NG流行株对喹诺酮类耐药率呈增长趋势;NG流行株对喹诺酮产生耐药性与gyrA和parC基因双重突变有着密切的关系.

　　Correlation of in vitro susceptibilities to quinolones of naturally occurring quinolone┐resistant Neisseria gonorrhoeae strains isolated with changes in gyrA and parC in China

　　WANG Sheng-Chun，LIU Yu-Feng，SU Ming-Quan，WANG Qiang

　　Center of Dermatology&Venereology of Chinese PLA，Center of Clinical Molecular Biology，Xijing Hospital，Fourth Military Medical University，Xi'an710033，China，Department of Urology，Affiliated Hospital，Jilin Military Medical College，Fourth Military Medical University，Jilin132001，China

　　Keywords:neisseria gonorrhoeae;drug tolerance;gyrA;parC

　　Abstract:AIM To investigate the status of Gonococcal flu-oroquinolone resistance and analyse the contribution of mech-anisms of quinolone resistance in N.gonorrhoeae.METH┐ODS The594N.gonorrhoeae strains isolated in China from1993to2001，were examined susceptible to ciprofloxacin.Seventy-six strains were highly resistant，18N.gonorrhoeae strains were investigated for the frequency and patterns of mutations within the gyrA and parC genes.To identify muta-tions in the gyrA and parC genes of the gonococcal mutants，the quinolone resistance determining regions of the gyrA and parC genes were amplified by polymerase chain reaction(PCR)and the PCR products were directly sequenced.The strains were analyzed for genetic relationship by pulsed-field gel electrophoresis(PFGE).RESULTS There was a trend of increasing detection rate of resistance strains every year，and the strains(MIC≥1mg?L-1 )increased from5.1%to21.4%during1993to2001.In control group，only2strains exhibited single mutation of gyrA，not parC mutation.In re-sistance group，alterations at Ser-91and Asp-95in gyrA and a single or double alteration in parC were identified in16strains(89%).Ser-91-to-Phe and Asp-95-to-Gly alterations in gyrA were detected in15strains(88.9%).The most com-mon parC alteration，Asp-86to Asn，was found in13strains(72%).The strains were analyzed for genetic relationship by PFGE.The analysis showed10strains with the same muta-tion pattern in the gyrA and parC genes，originating from dif-ferent geographical areas over nine years，had the same PFGE patterns after NheI digestion.CONCLUSION The results from this study suggest that resistance strains would be increasing in China;double gyrA mutations plus a parC mutation(s)play an important role in the development of high-level fluoroquinolone resistance in N.gonorrhoeae.

　　引言

　　近几年来，发达国家的淋病发病率虽有所降低，但在全球范围内依然占据性传播疾病(STD)发病率之首.同时淋病奈瑟氏菌(N.gonorrheae，NG)的多重耐药性的比例却显著增加[1] .喹诺酮类化合物是一种广谱抗生素，作为单纯淋病治疗的一线药物正在包括我国在内的许多国家和地区使用[2] .随着该类药物广泛应用，多种细菌对其产生不同程度的耐药性[3-5] .在过去的十年，在一些国家和地区发现了NG对喹诺酮类的敏感性降低甚至出现了耐药，喹诺酮类耐药株(QRNG)在东南亚和西太平洋地区的流行尤为普遍[6-10] .DNA螺旋酶(Gyrase)和拓朴异构酶Ⅳ是喹诺酮类药物的作用靶位.前者是由细菌染色体DNA上的螺旋酶A亚单位基因(gyrA)编码的，而后者是由DNA拓朴异构酶ⅣA亚单位(praC)编码[11，12] .QRNG对环丙沙星(CIP)的耐药水平与gyrA和praC的特定区域突变的位点和数量有关.分析gyrA和praC的突变模式，可以追踪菌株QRNG的流行动态[10] .许多国家和地区都建立了完善的STD监测机构，有关NG的耐药状况及耐药性机制一直做动态跟踪研究.国内这方面的研究尚未见报道，本研究报告了1993/2001-06在中国三地临床分离的QRNG株的耐药状况，gyr A和pra C基因突变发生频率及突变模式.同时还通过PFEG检测分析了18株QRNG的遗传关系.

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1993/2001在长春、湛江、西安三地共分离出NG604株.菌株的分离培养鉴定的方法按文献[13]方法进行.菌株纯化后，在三次传代之前，所有的菌株均做抗生素敏感性的测定，其中对CIP高水平耐药的(MIC4～32mg?L-1 )的18株作为重点研究.核酸内切酶NheI(New England Biolabs).

　　1.2 方法

　　1.2.1 NG敏感性的测定

　　所有的菌株均检测了对CIP的敏感性(T-M培养基，平板稀释法).抗生素浓度分布采用倍比稀释法，具体如下:CIP0.001～32mg?L-1 ;MICs≤0.03mg?L-1 ，为敏感;0.06～0.5mg?L-1 为中敏;≥1.0mg?L-1 为耐药[10] .

　　1.2.2 gyrA和parC基因的测定

　　参照Albert等[11] 的方法进行.在保存的流行菌株中，分别选取每年的敏感株和高水平耐药株(MIC≥4mg?L-1 )各2株，分成敏感(S)和耐药(R)两组，每组各18株.用PCR方法扩增出全部36株的染色体基因片段，这些片段包含gyrA和parC的喹诺酮耐药性决定区(QR- DR).针对gyrA基因扩增所使用的引物是:GA1(5'-AGCTATCTCGACTACGCC-3')和GA2(5'-CCGAAACTGTCTTGCAGC-3')，扩增片段长度937bp，相对应的氨基酸是第28位到第340位(Gen-Bank accession no.UO8817).parC的引物PAR1(5'-TCTCGAATACGCCATGAGCG-3')和PAR2(5'-ATTGTGCGACGGAATCTCGG-3')，长度495bp、氨基酸为26到190位(GenBank UO8907).扩增子直接DNA序列测定检测gyrA和parC基因突变.两种扩增子DNA序列分析，使用ABI PRISM生物分析工具.

　　1.2.3 PFEG分析

　　基因组DNA准备，参照Su等[14] 的方法进行.包含DNA的琼脂糖凝胶块，用NheI消化，在包含10u限制性核酸内切酶的100μL缓冲液37℃过夜.将消化产物进行10g?L-1 琼脂糖凝胶电泳(均质电场，CHEF DRIIPS).工作条件是22h，12℃，电压6V?cm-1 ，脉冲时间1～40s.将凝胶进行溴化乙啶染色，蒸馏水清洗，紫外线透视照相.然后使用凝胶分析器成像扫描系统，PFGE指纹分析使用GELCOMPAR软件分析PFEG带型相似度.

　　2 结果

　　2.1 CIP的敏感性

　　对三地9a收集的菌株进行耐药性检测，第一株高水平CIP耐药株出现在1993年(MIC≥4mg?L-1 ).1993/2001，敏感株的比例呈现下降趋势，耐药株(MIC≥1mg?L-1 )所占比例由5.1%上升到21.4%(Tab1).87%的分离株可以被0.06mg?L-1 到0.5mg?L-1 的CIP所抑制.其中，74株(13%)为耐药株，在耐药株中，17株(23%)MIC为1～2mg?L-1 ;另外的57株(77%)的MIC为4～32mg?L-1 .

　　2.2 gyrA和parC基因突变模式

　　18株高敏感株只有两株发生了单一的gyrA的Ser91向Phe变异，在这一组中未发现parC的变异.而耐药组则普遍地发生变异，Tab2显示了18株高水平喹诺酮耐药株gyrA和parC基因突变模式.我们发现了这些菌株gyrA和parC多重突变.除2株包含单一的gyrA的91位密码子的突变外，其余菌株(除一株外)均在parC基因第91位和95位密码子发生了双重或多重突变.

　　在gyrA突变鉴定中，Ser91向Phe的突变是普遍的，在所有的18个高水平耐药株中均发生了这种模式的突变(100%);Asp-95→Gly模式发生在14株(77.7%);Asp95→Asn突变模式有2株(11.1%).1株是单一的Ser91→Phe突变(5.1%);两株为Ser91→Phe和Asp-95→Asn的双突变模式(11.1%);15株为Ser-91→Phe和Asp-95→Gly双重突变模式(88.9%).

　　表1 1993/2001淋球菌中国流行株对CIP的敏感性(略)

　　Tab1 Susceptibility to ciprofloxacin of N.gonorrhoeae strains isolated in Chinese from1993to2001

　　表2 18株耐CIP淋球菌分离株gyrA和parC基因的核酸突变及其相应氨基酸的变异(略)

　　Tab2 Amino acid substitutions within gyrA and parC of18strains N.gonorrhoeae and associated nucleotide substitutions Pattern Substitution at indicated position

　　parC基因序列分析提示，出现了86，87，88，91和131等位点的多点突变.最普遍的点突变模式是Asp-86→Asn，共有13株属于这种情况(72%).在131位密码子的CTC至CTG的DNA序列突变的也是13株(72.2%).发现了1株Glu-91→Lys突变模式(5.1%)，而Sre-88→Pro模式1株(5.1%);Ser-87→Arg1株(5.1%).

　　18株gyrA和parC的联合突变的8种模式中，61%(11株)的突变模式为gyrA的Ser-91→Phe，Asp-95→Gly伴有parC的Asp-86→Asn.

　　2.3 PFEG分析

　　所有18株NG的染色体DNA经核酸内切酶NheⅠ酶切处理后，用PFEG分析.NheⅠ消化后显示约12～19条带，Mr约(2～6.5)×104 .以NheⅠ酶切图谱的90%相似度为依据可分为6组.其中表2中列出的具有M6突变模式的8株，NheⅠ酶切图谱具有90%以上的相似度，其酶切图谱如Fig1所示.Fig2列出了其余耐药株NheⅠ酶切图谱，可以发现有6株仅表现为唯一的NheⅠ模式，相互间相似度均<90%.显示了这些株的遗传独立性.

　　图1 M6突变模式(Tab2)的8株喹诺酮耐药株基因组DNA的NheI酶切图(略)

　　Fig1 PFGE analysis of genomic DNAs from M6mutation pattern N.gonorrhoeae strains digested with NheI

　　图2 其他突变模式(Tab2)的10株喹诺酮耐药株基因DNA的NheI酶切图(略)

　　Fig2 PFGE analysis of genomic DNAs from other mutation pattern10strains N.gonorrhoeae digested with NheI

　　3 讨论

　　喹诺酮类抗生素是通过抑制DNA复制和重组所必须的拓扑异构酶而起到抑菌作用的.DNA螺旋酶是细菌特有的一种拓扑异构酶，它和拓扑异构酶Ⅳ共同作用维持着细胞内正常的超螺旋水平，在ATP的参与下能使松弛的环状DNA转变为负超螺旋的 形式，对DNA的复制、转录、重组和修复过程有着重要的作用.细菌对喹诺酮的耐药性与DNA螺旋酶gyrA亚单位及DNA拓扑异构酶Ⅳ的parC亚单位相关.淋球菌高水平喹诺酮耐药性发生是通过渐进式突变形成的[14] .1990年以前NG分离株对CIP完全敏感，也未发现gyrA和parC突变，或只有单一gyrA突变[15] .当一个低敏感株被检测到parC突变时，只是单一的gyrA出现变异[14] .绝大多数的CIP耐药株(MICs≥1mg?L-1 )出现gyrA基因编码91位和95位氨基酸变异，以及最低限度的parC变异[12，14] .

　　我们的研究表明，国内分离的CIP耐药株(MIC4-32mg?L-1 )的1993/2001分离株100%包含了gyrA的91位和95位的单一的或双倍parC突变.而对照组的18个敏感株只有2株发生了单一的Ser-91变异，并且没有发现parC突变.该结果强烈地提示parC及gyrA双突变在NG高水平CIP耐药株形成过程中起重大作用.parC突变的数量与CIP耐药性没有相关性，过去发现parC突变模式的不同表现出耐药水平的差异(MICs8～64)[16] .

　　PFEG被认为是分子分型方法的可信的方法，成功地运用于Gram阳性菌和Gram阴性菌的分型.来源于不同年份不同地区(长春、湛江和西安)的8株NG用此法证实了它们本是一组，具有同源性.从而提示了这一常见的耐药性克隆已经在国内广泛地传播.它们gyrA和parC突变模式也是一致的，证实了遗传关系假设.两年来数千公里以外的NG菌株之间的密切关系，来源于清晰定位的“重复”.无论gy-rA和parC的突变模式还是对CIP的耐药性，从一些患者或性伴侣之间的分离株，都没有差异.同时性伴侣分离株之间NheΙ的模式也没有差异，确定了他们之间是同基因及流行病学关系.

　　通过该研究，对喹诺酮耐药的NG中国流行株的数量在增加.高水平的CIP耐药株的形成主要原因是gyrA基因的Ser-91和Asp-95的突变或者是单一的和双位的parC基因突变.流行株特定突变模式的发现，对临床药物的选择和新一类抗生素的开发无疑具有重要的意义.

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