“高效价抗角蛋白自身抗体注射液”的主要药效学研究

作者：李承新，李 巍，刘玉峰，李 冰，赵小东，黄 慧，高天文

　　关键词: 角蛋白;自身抗体;注射;银屑病;皮炎，接触性;动物，实验

　　中图号:R751.05

　　摘 要:目的 观察“高效价抗角蛋白自身抗体注射液”(AKAAI)对银屑病和接触性皮炎动物模型的治疗作用，为AKAAI进入临床试验提供药效学资料. 方法 制备心得安豚鼠银屑病样皮炎和硫化钠家兔刺激性接触性皮炎的动物模型，分别将两种模型的实验动物分为5组，治疗组按3个剂量(2.5，5，10mg kg-1 )给予实验动物im AKAAI，同时设立生理盐水组和去除AK auto Ab的丙种球蛋白组作对照.定期观察进行大体评分，并取皮损标本固定、包埋，光镜观察组织学变化. 结果 豚鼠耳廓涂药前后组织学差异显著.im10d后，AKAAI治疗组豚鼠耳廓组织学中银屑病病理现象基本消失，且有明显的剂量效应关系，而NS组与Ig组的组织学改变不明显.饱和硫化钠溶液所致家兔接触性皮炎的反应强度各组间较一致，与对照组相比，im给药5及7d后，AKAAI治疗组大体评分和组织学炎症反应强度分别出现显著性差异，并表现出明显的剂量效应关系.AKAAI治疗组的疗程明显短于对照组. 结论 AKAAI能明显促进豚鼠耳廓银屑病样皮炎和家兔接触性皮炎的恢复及愈合，缩短疗程，显示了良好的治疗作用，为AKAAI进行临床试验提供了有力依据.

　　Pharmacodynamic studies on“the anti┐keratin au┐toantibody injection”

　　LI Cheng-Xin，LI Wei，LIU Yu-Feng，LI Bing，ZHAO Xiao-Dong，HUANG Hui，GAO Tian-Wen

　　Center of Dermatology&Venereology of Chinese PLA，Xijing Hospital，Fourth Military Medical U-niversity，Xi'an710033，China

　　Abstract:AIM To explore the effects of anti-keratin au-toantibody injection(AKAAI)on guinea-pig's psoriatic mod-el and rabbit's contact dermatitic model.METHODS After the guinea-pig's psoriatic model and rabbit's contact der-matitic model were prepared，animals of each kind model were divided into5groups:2.5，5，10mg kg-1 AKAAI as therapeutical groups，NS group and immunoglobulin without AK auto Ab(Ig)as control.Marks of inflammatory grade of animal skin were recorded at given time.Biopsy of skin speci-men were followed histologically under light microscope.RE┐SULTS There was a significant difference of guinea-pig ear skin's histology before and after local application of propra-nolol.Ten days after treatment with AKAAI psoriatic histo-logical features of guinea-pig auricle skin in AKAAI groups almost disappeared in a dose-dependent manner，however，that in NS and Ig group showed no significant changes.In-flammatory intensity of contact dermatitis induced by sodium sulfide among5groups was well-distributed.Compared with control groups，marks of animal and histology in AKAAI groups presented a dose-dependent significant difference5d and7d respectively after treatment with AKAAI，and course of treatment in AKAAI group was shorter than that in con-trol groups'.CONCLUSION AKAAI could promote the re-covery and healing of guinea-pig auricle psoriatic dermatitis and rabbit contact dermatitis，shorten the course of treat-ment，which indicates positive therapeutical effect of AKAAI.

　　引言

　　现已明确，天然自身抗体(natural autoantibody，NAA)具有参与机体对外来损伤的非特异性防御、加速代谢产物的清除、抗炎等作用[1] .天然抗角蛋白自身抗体(antikeratin autoantibody，AK auto Ab)作为天然自身抗体家族中一员，广泛存在于人和多种动物体内，对维持皮肤的稳定有重要意义.研究表明，正常人AK auto Ab可以抑制体外培养的人角质形成细胞的增殖代谢[2] ，并可以抑制角质形成细胞产生IL-6，IL-8等[3] ，进而抑制这些免疫炎症介质介导的皮肤炎症反应.这些结果提示，AK auto Ab对角质形成细胞过度增殖性皮肤病，如银屑病等可能会有潜在的治疗作用.我们初步的动物实验也显示，来自豚鼠的AK auto Ab对豚鼠银屑病样皮炎有明显的治疗作用.为加快开发AK auto Ab潜在的临床应用价值，我们利用生物高技术手段，自正常人血清中制备出高效价抗角蛋白自身抗体注射液(anti-keratin au-toantibody injection，AKAAI)，并按照药学研究标准对其主要药效学进行了体内实验观察.

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　高效价抗角蛋白自身抗体注射液由本实验室自行制备[4，5] .心得安(江苏武进制药厂)，硫化钠(Na2 S)(西安化学试剂厂).健康成年豚鼠300～400g和成年新西兰白兔2.0～2.5kg各60只，雌雄兼用，均由本校实验动物研究中心提供.按文献[6]的方法制备豚鼠银屑病动物模型.用5g L-1 心得安乳剂均匀涂抹双耳背，每耳每次用药量约0.3g，4次 d-1 ，3wk，使双耳变红、增厚.HE染色镜检见表皮增生、角化不全等银屑病样改变.按文献[7]的方法用饱和硫化钠(Na2 S)溶液作用于所有动物左背后1/2区域(约占体表面积的15%)，诱发刺激性接触性皮炎，表现为作用区域脱毛，局部皮肤红斑、肿胀及少许糜烂.

　　1.2 方法

　　将动物随机分成每组12只.对AKAAI各指标均分别im大、中、小(10，5和2.5mg (kg d)-1 )3个剂量的比较实验，同时设生理盐水(NS)和去除AK auto Ab的丙种球蛋白(以下简称丙种球蛋白组，Ig)为对照.AKAAI治疗组每日给药1次，连续14d.Ig组按5mg kg-1 给药(每只0.8mL)，生理盐水组给予每只0.8mL.分别于治疗前、给药后10，15d取豚鼠耳廓标本，固定、脱水、包埋后制作石蜡切片，HE染色观察评分，并将各组结果进行统计处理.家兔接触性皮炎模型在Na2 S作用后2h即im药物，1次 d-1 ，14d.Ig组按5mg kg-1 给药，方法同上，生理盐水组给予5mL.分别于给药1，3，5，7，9，12d对家兔皮肤反应强度进行大体评分，并于1，3，7，12d取皮损部位标本，固定、脱水、包埋后制作石蜡切片，HE染色.高倍镜下每个标本在真皮浅层随机选5个视野，对真皮附属器以外的有核细胞进行计数，以记录组织学评分.每张切片均由3人观察及评分，取其 平均值后将各组结果进行统计学处理.

　　统计学处理:数据以x ±s表示，用组间t检验进行统计学处理.

　　2 结果

　　2.1 模型评价

　　2.1.1 银屑病模型

　　模型的评价采用豚鼠银屑病组织学评分方法:Munro小脓肿1.5分，角化不全0.5～1.5分，角化过度0.5分，表皮突延长0.5～1.5分，棘层肥厚1.0分，颗粒层变薄或消失1.0分，淋巴细胞浸润0.5～1.5分，真皮乳突顶端呈杵状1.0分，毛细血管扩张0.5分.按此标准，正常豚鼠耳廓皮肤组织学(Fig1A)评分平均为0.81±0.19，心得安涂药3wk后全部标本均见到角化过度、棘层肥厚、乳突内有炎细胞浸润.大部分可见到广泛或灶状角化不全、颗粒层变薄或消失、表皮突延伸呈棒状、乳突上伸、顶端呈杵状及毛细血管扩张.少部分标本可见到角层内小脓疡(Munro小脓肿)(Fig1B)，组织学评分平均为7.33±0.73(P<0.01)，表明已成功建立了银屑病的动物模型，涂药后各组间(治疗前)组织学评分比较无显著性差异.

　　2.1.2 接触性皮炎模型

　　参照文献[8]制定皮肤反应强度分级标准.红斑:无反应为0，散在红点为0.5，非连续红斑为1.0，连续红斑为2.0，中度红斑为3.0，重度红斑为4.0.肿胀:无反应为0，轻度水肿为2.0，中度水肿为3.0，重度水肿为4.0.糜烂:无反应为0，轻度糜烂为4.0，中度糜烂为5.0，重度糜烂或溃疡为6.0.饱和Na S溶液作用于家兔皮肤立刻引起局部红斑、肿胀及少许糜烂，炎症于1～2d内达到高峰.各组间反应较均匀一致(P>0.05)，炎症反应强度及有核细胞浸润数无差异(P>0.05).

　　2.2 AKAAI对银屑病模型的作用

　　AKAAI im10d后，豚鼠耳廓组织学中银屑病样病理改变基本消失(Fig1C，D)，2.5，5，10mg kg-1 3个剂量组的组织学改变相似，与治疗前(7.33±0.73)相比较，10d时的组织学评分分别为4.07±0.67，3.42±0.63和2.41±0.83(P<0.01)，而NS组与Ig组10d时的组织学评分分别为6.17±0.92和5.88±0.71，与治疗前相比组织学改变不明显(P>0.05)(Fig1E，F).在15d时，虽然NS组与Ig组的组织学也有较大恢复，组织学评分分别为5.33±0.51和4.93±0.57(与治疗前相比，P<0.05)，但此时AKAAI的3个剂量组均已明显接近正常(1.41±0.35，0.96±0.56和0.83±0.09).

　　图1 豚鼠耳廓银屑病样皮炎组织学的变化(略)

　　Fig1 Histological changes of guinea-pig auricle psoriatic dermatitis

　　2.3 AKAAI对刺激性接触性皮炎模型的作用

　　各组动物皮肤反应强度大体评分在1，3d各组间无显著性差异，自5d起AKAAI治疗组与两对照组间相比较开始出现显著性差异，至9d时各组间皮肤炎症的大体评分差异最明显，并表现出剂量效应关系(Fig2).NS组、Ig组及AKAAI3个剂量组(2.5，5，10mg kg-1 )治疗家兔接触性皮炎的治愈时间(d)分别依次为17.5±0.8，17.0±1.2，13.3±0.9，11.5±0.7和9.6±1.1.在组织学上以真皮浅层有核细胞计数来评价皮肤炎症反应强度.1，3d各组间差异无显著性.自7d起AKAAI治疗组与两对照组相比较差异显著(Fig3，4).

　　图2 家兔接触性皮炎不同时间点的大体评分(略)

　　Fig2 Marks of rabbit contact dermatitis at different time

　　图3 家兔接触性皮炎不同时间点的组织学评分(略)

　　Fig3 Histological marks of rabbit contact dermatitis at dif-ferent time

　　3 讨论

　　天然自身抗体(natural autoantibody，NAA)，在维持机体自身稳定，特别是在免疫系统的平衡中发挥着重要的作用[1] .阐明NAA的作用、意义已受到越来越多的重视.作为NAA家族中重要的一员，天然抗角蛋白自身抗体(antikeratin autoantibody，AK auto Ab)自从发现以来，众多学者进行了广泛的研究，已取得了明显进展[9] .业已证明，AK auto Ab与银屑病关系密切，银屑病患者血清AK auto Ab水平下降[10] .体外实验发现，纯化的血清AK auto Ab可以抑制角质形成细胞的生长[2] ，并促进其凋亡，AK auto Ab还可以抑制角质形成细胞产生IL-6和IL-8等炎症因子[3] ，鉴于AK auto Ab在皮肤冻伤、烫伤等临床病理状态中的积极作用[11，12] ，表明AK auto Ab在维持皮肤的平衡与稳定中，特别是在防止角质形成细胞过度增殖、减轻皮肤炎症中有重要作用.因此，积极开发和利用AK auto Ab的生物学作用来治疗象银屑病等目前尚无满意疗法的皮肤疾患具有广阔的临床价值和重要的社会意义.

　　Gaylarde等[6] 将心得安涂在豚鼠背侧皮肤造成了表皮角化过度、角化不全和棘层肥厚等类似银屑病的组织学改变，并指出此改变系心得安特有的药理作用所致.该模型已成为银屑病研究和药物筛选的重要工具.因此，为更加准确反映AKAAI在体内的作用效果，我们选择了这种动物模型.结果显示，分组处理10d后AKAAI三个剂量组的评分均有下降，以10mg kg-1 组评分下降最明显，而NS和Ig组评分无明显变化.表明AKAAI对银屑病样皮炎的修复具有积极的促进作用.这种促进作用可能与AKAAI中的AK auto Ab抑制角质形成细胞的过度增殖有关.在临床上也发现，银屑病患者的血清中AK autoAb的总滴度下降，而在患者鳞屑中有大量的AK au-to Ab沉积[13] .结合体外实验中AK auto Ab对培养角质形成细胞的抑制作用，可以认为这种沉积是一种自发的保护反应，有利于限制表皮的过度增生，控制病情进展.

　　我们曾发现，AK auto Ab不仅对银屑病有积极的影响，而且对多种皮肤疾患都可能有潜在的治疗作用，如接触性皮炎[14] 、冻伤[11] 、烫伤[12] 等.但以往的研究大多采用间接的方法，且缺少严格的药物研究标准，为使AK auto Ab的应用尽快向临床过渡，并扩大其适应症，我们观察了AKAAI对家兔刺激性接触性皮炎的影响.肉眼及光镜观察的结果显示，AKAAI作用于家兔硫化钠接触性皮炎动物模型后，治疗组动物皮肤炎症消退迅速，皮肤损伤修复快，脱痂早，愈合好，与两对照组差异显著，而两对照组之间无显著性差异.表明AK auto Ab积极参与了动物接触性皮炎的炎症反应及修复过程，并发挥其影响.但是，AKAAI治疗接触性皮炎的机理还有待于进一步研究和确证.

　　图4 家兔接触性皮炎组织学特点的变化

　　Fig4 Histological changes of rabbit contact dermatitis

　　参考文献:

　　[1]Lacroix-Desmazes S，Kaveri SV，Mouthon L，Ayouba A，Malanchere E，Coutinho A，Kazatchkine MD.Self-reactive an-tibodies(natural autoantibodies)in healthy individuals [J].J Immunol Methods，1998;216:117-137.

　　[2]Li CX，Liu YF，Liu YF，Zhang YG.Effect of purified antiker-atin autoantibodies on cultured keratinocytes [J].Zhonghua Pifuke Zazhi(Chin J Dermatol)，1996;29(2):118-119.

　　[3]Zhang YG，Liu YF，Liu YF，Wang G，Li CX.Influence of an-tikeratin autoantibodies on the production of IL-8from ker-atinocytes [J].Zhongguo PifuxingbingxueZazhi(Chin J Der-matol Venereol)，1996;10:201-202.

　　[4]Li CX，Liu YF，Liu YF.Preparation of keratin affinity column [J].Di-si Junyi Daxue Xuebao(J Fourth Mil Med Univ)，1994;15(3):231-232.

　　[5]Li CX，Liu YF，Liu YF，Zhang TS.Extraction and identifica-tion of antikeratin autoantibodies from normal human serum [J].Zhonghua Pifuke Zazhi(Chin J Dermatol)，1995;28(4):248-249.

　　[6]Gaylarde PM.Psoriasiform changes in guinea-pig skin from pro-pranol [J].Clin Exp Dermatol，1978;3:157-160.

　　[7]Liu YF，Liu YF，Ding HY，Zhang TS，Che NZ.Dynamic ob-servation of antikeratin autoantibodies in rabbit contact der-matitis [J].Zhonghua PifukeZazhi(Chin J Dermatol)，1990;23:248-249.

　　[8]Roper SS，Jones HE.An animal mode for altering the irritablity threshold of normal skin [J].Contact Dermatitis，1985;13:91-97.

　　[9]Wang G，Liu YF.Research progress and speculations of antik-eratin autoantibodies [J].Zhongguo Pifuxingbingxue Zazhi(Chin J Dermatol Venereol)，2000;14:49-50.

　　[10]Liu YF，Liu YF，Zhang TS，Ding HY.Immunohistochemical study of anti-keratin autoantibodies in both normal and patho-logical state [J].Zhonghua Yixue Zazhi(Chin Med J)，1993;106:393-395.

　　[11]Liu YF，Zhang TS，Liao WJ，Wang HY，Ding LQ.Influence of anti-keratin autoantibodies on the cold injury of skin [J].YixueXingxi Huicui(Med Inform Assem)，1994;7:31-32.

　　[12]Liu YF，Liu YF，Zhang TS，Ding HY，Liao WJ.Effects of an-ti-keratin autoantibodies on the skin scald [J].Zhongguo Pi-fuxingbingxue Zazhi(Chin J Dermatol Venereol)，1992;6:67-68.

　　[13]Zhang TS，Li CX，Liu YF，Liu YF，Wang G.Purification and identification of antikeratin autoantibidies from the scale of pa-tients with psoriasis [J].Di-si Junyi Daxue Xuebao(J Fourth Mil Med Univ)，1994;15:151-152.

　　[14]Liu YF，Liu YF，Zhang TS，Ding HY，Liao WJ.Effects of an-ti-keratin autoantibodies on the contact dermatitis [J ].Zhonghua Pifuxingbingxue Zazhi(Chin J Dermatol Venereol)，1992;6:8-9.