抗角蛋白自身抗体对无血清培养黑素细胞及角质形成细胞增殖的影响

作者：孙林潮，刘玉峰，刘彦仿，张泰山

　　【关键词】 角蛋白

　　关键词: 角蛋白;自身抗体;黑素细胞;角蛋白细胞

　　中图号:R329.2 + 5

　　摘 要:目的 建立一种无血清传代培养黑素细胞的方法，并观察抗角蛋白自身抗体(AK auto Ab)对无血清培养黑素细胞及角质形成细胞增殖的影响. 方法 应用角质形成细胞无血清培养基(KC-SFM)添加牛垂体浸出液(BPE)和TPA传代培养黑素细胞，应用KC-SFM添加EGF和BPE传代培养角质形成细胞，培养均至第3代时于培养基中加入不同浓度的AK auto Ab，用MTT法观察AK auto Ab对两种细胞增殖的影响. 结果 应用无血清培养基成功地传代培养了黑素细胞，MTT法结果显示AK auto Ab各浓度组对培养黑素细胞的增殖无明显影响，但对角质形成细胞的增殖有显著抑制作用并有浓度依赖性. 结论 建立了一种无血清培养黑素细胞的方法，AK auto Ab对黑素细胞的增殖无抑制作用而对角质形成细胞有特异性抑制作用.

　　Effect of anti┐keratin autoantibody on proliferation of melanocytes and keratinocytes cultured with serum┐free medium

　　SUN Lin-Chao ，LIU Yu-Feng，LIU Yan-Fang，ZHANG Tai-Shan

　　Center of Dermatology&Venereology of Chinese PLA，Xijing Hospital，Department of Pathology，Faculty of Preclinical Medicine，Fourth Military Medical University，Xi'an710033，China

　　Keywords:keratin;autoantibodies;melanocytes;ker-atinocytes

　　Abstract:AIM To observe the effect of anti-keratin autoan-tibody(AK auto Ab)on proliferation of melanocytes and keratinocytes cultured with serum-free medium.METHODS Human melanocytes were cultured with KC-SFM supple-mented with BPE and TPA while human keratinocytes were cultured with KC-SFM in the presence of EGF and BPE.Ef-fects of different titers of AK auto Ab in medium on prolifer-ation of melanocytes and keratinocytes were observed by means of MTT.RESULTS AK auto Ab had no effects on melanocytes but markedly inhibited the growth of target cells，keratinocytes，in a dose-dependent manner.CONCLU┐SION We develope a serum-free approach to the cultivation of melanocytes.AK auto Ab can selectively inhibite prolifera-tion of keratinocytes.

　　引言

　　无血清培养纯黑素细胞是人们十分关注的一项研究课题.通常情况下黑素细胞较难培养成功，因为黑素细胞的生长易受角质形成细胞生长的影响，直到1982年，Eisinger和Marko[1] 首先用含有TPA、CT和50mL?L-1 胎牛血清的MEM培养液成功地获得黑素细胞体外纯培养，其中TPA起选择性抑制角质形成细胞的作用.但由于血清成分不明，不易人为控制，影响黑素细胞的精细研究.1989年Pittelkow等[2] 用MCDB153培养基加入胰岛素、EGF，BPE及TPA进行表皮细胞原代培养时得到以黑素细胞为主、角质形成细胞占少数的混合生长物，然而通过差别胰酶处理(黑素细胞附着不如角质形成细胞牢固)纯化黑素细胞，在上述含TPA的无血清培养基进行传代培养，黑素细胞生长良好.我们首次应用KC-SFM简单添加BPE和TPA进行了黑素细胞原代及传代培养.

　　以往的研究表明抗角蛋白自身抗体(anti-keratin autoantibidy，AK auto Ab)对体外培养角质形成细胞有抑制增殖的作用[3-5] ，但均未用过其他细胞作为对照.为证实AK auto Ab对角质形成细胞作用的特异性，我们用MTT法观察了AK auto Ab对无血清培养黑素细胞和角质形成细胞增殖的影响.

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　KC-SFM，EGF，BPE为GIBCO公司产品，TPA，MTT为Sigma公司产品，AK auto Ab为本室自制[6] .角质形成细胞无血清培养基配制:KC-SFM500mL加入EGF2.5μg及BPE25mg;黑素细胞无血清培养基配制:KC-SFM500mL加入TPA5μg及BPE25mg.

　　1.2 方法

　　1.2.1 黑素细胞无血清培养

　　用KC-SFM加BPE，TPA而配成的黑素细胞无血清培养基制备表皮细胞单细胞悬液，调整细胞浓度为(5×108 )?L-1 接种于25mL培养瓶内，每瓶1.5mL，48h换液，以后每72h换液一次，待细胞基本铺满板底后(12d左右)，用2.5g?L-1 胰蛋白酶消化，至黑素细胞树突回缩立即用等量含胎牛血清的DMEM终止消化，小心吹打瓶底使黑色素细胞脱离，混杂生长的角质形成细胞因贴壁比黑素细胞牢固可不被吹打下来(此即所谓“差别胰酶处理”，可使传代细胞得到基本纯化)，将黑色素细胞悬液低速离心，沉淀重悬于黑素细胞无血清培养基，调整细胞浓度为(5×107 )?L-1 接种于新的培养瓶内.48h换液一次，每次换2/3培养液.MTT实验用第3代细胞.

　　1.2.2 角质形成细胞无血清培养

　　按Li等[7] 的方法进行，取第3代细胞进行MTT实验.

　　1.2.3 MTT比色实验

　　将第3代对数生长期黑素细胞及角质形成细胞消化接种于96孔培养板，每孔5×103 个细胞，培养48h后更换分别含20，10，5，2.5，1.25及0.625g?L-1 AK auto Ab的KC-SFM，设KC-SFM空白对照，各设6个复孔，隔日更换1次新的处理液，继续培养5d后每孔加入20μL MTT溶液(浓度为5g?L-1 ，用PBS稀释)37℃继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内上清液，每孔加入150μL DMSO，振荡10min，使结晶物充分溶解，选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值(A值).

　　2 结果

　　2.1 黑素细胞无血清培养

　　应用KC-SFM加TPA，BPE原代培养24h即可见黑素细胞已散在贴壁，角质形成细胞则绝大部分未贴壁，48h首次换液，吸去未贴壁的角质形成细胞，倒置显微镜下见贴壁生长的黑素细胞呈梭形，有2个或多个树突，培养时间延长，黑素细胞增殖并连接成网状，此时高倍镜下可见黑素细胞胞体内充满黑色素颗粒，树突顶端常见一黑色素颗粒，12d左右黑素细胞基本铺满瓶底， 但仍可见散在少量角质形成细胞，经差别胰蛋白酶处理后传代细胞易贴壁生长，培养10d即铺满瓶底，基本不再有角质形成细胞.传代细胞行多巴染色后可见胞体及树突上有棕黑色颗粒沉着.

　　2.2 MTT实验结果

　　角质形成细胞加入不同浓度AK auto Ab后A值变小，有明显剂量相关性，经t检验各组间两两比较均有明显差别(P<0.01)，说明AK auto Ab对角质形成细胞增殖有抑制作用.而在黑素细胞中加入不同浓度AK auto Ab后A值无明显改变，t检验各组间两两比较无明显差别(P>0.05，Tab1).

　　表1 MTT实验结果(略)

　　Tab1 Result of MTT colorimetric determination

　　3 讨论

　　黑素细胞培养对研究黑素细胞的细胞生理及色素性疾病的病因、病理生理和治疗等提供重要的依据和途径[8-10] .传统培养方法多在培养液中加入TPA，CT，IBMX及一定比例的血清，血清除了提供细胞生长的营养成分外，还促进细胞DNA的合成，并含有细胞增殖所必需的生长因子，但由于血清成分非常复杂，对一些要求较高的基础性研究的结果影响较大，同时血清中也含有一定的细胞毒性物质和抑制物质对细胞有去分化的作用，影响某些细胞功能的表达，因而无血清培养技术历来受培养工作者的重视.1989年Pittelkow等[2] 以MCDB153作为基本培养液，再加入胰岛素、EGF、BPE配成了“MCDB153完全培养基”.再加入TPA进行了无血清黑素细胞原代及传代培养，黑素细胞生长良好.

　　KC-SFM为MCDB153的改良产品，其成分同上述“MCDB153完全培养基”基本一致，我们首次应用KC-SFM简单添加BPE及TPA进行了黑素细胞无血清培养，黑素细胞原代及传代生长均良好.KC-SFM加BPE及TPA为黑素细胞无血清培养提供了一种新的较为简便的方法，为黑素细胞的体外研究提供了理想的实验模型，可在黑素细胞的生长、分化调控，角质形成细胞和黑素细胞的相互作用以及表皮自分泌和旁分泌生长调节的意义等精细研究方面得到广泛应用.

　　我们应用MTT比色实验发现AK auto Ab不影响无血清培养黑素细胞的生长增殖，但AK auto Ab对无血清培养角质形成细胞有显著杀伤作用，这说明AK auto Ab的作用具有细胞特异性.应用胶体金―银技术进行免疫电镜研究证实，AK auto Ab主要结合于角质形成细胞的张力纤维和桥粒上[11] ，由于黑素细胞内没有能与AK auto Ab发生结合的张力纤维和桥粒结构，因而AK auto Ab对黑素细胞无直接作用.角质形成细胞的张力细丝(KIF)的功能一是作为支撑细胞的骨架，二是在细胞的信号传导中起重要作用，Steinert等发现KIF在终末分化的表皮细胞经历了快速磷酸盐交换[12] ，因而我们推测AK auto Ab可能通过影响KIF，改变角质形成细胞信号传导和基因表达，从而引起角质形成细胞的特异性改变.

　　参考文献:

　　[1]Eisinger M，Marko O.Selective proliferation of normal human melanocytes in vitro in the presence of phorbol ester and cholera toxin [J].Proc Natl Acad Sci USA，1982;79(6):2018-2022.

　　[2]Pittelkow MR，Shipley GD.Serum-free culture of normal hu- man melanocytes:Growth kinetics and growth factor require-ments [J].J Cell Physiol，1989;140(3):565-576.

　　[3]Wang G，Liu YF，Liu YF.The effect of AK auto Ab on the metabolism activity of cultured keratinocytes [J].Zhonghua Pi-fuke Zazhi(Chin J Dermatol)，1994;27(2):94-95.

　　[4]Ju Y，Li CX，Liu YF，Wang WQ，Li W，Li ZQ，Zhao XD，Zhou SY.Influence of IgF(ab')2Of natural antikeratin au-toantibody on the proliferation of cultured keratinocytes [J].Di-si Junyi Daxue Xuebao(J Fourth Mil Med Univ)，2000;21(9):Cover2.

　　[5]Wang WQ，Liu YF，Zhao XD，Gao TW.Ak Auto Ab inhibits proliferation of KC and SCC [J].Di-si Junyi Daxue Xuebao(J Fourth Mil Med Univ)，2000;21(9):1165-1167.

　　[6]Li CX，Liu YF，Liu YF，Zhang TS.The extraction and identifi-cation of AK auto Ab in the serum of normal person [J].Zhonghua Pifuke Zazhi(Chin J Dermatol)，1995;28(4):248-249.

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　　[11]Liu YF，Liu YF，Ding HY.Immuno-histochemical studies on anti-keratin autoantibody [J].Jiefangjun Yixue Zazhi(J Med Coll PLA)，1990;5(2):165-167.

　　[12]Steinert PM.Intermediate filament dynamics [J].Cell，1990;60(4):521-523.