正交设计优化钟花报春花总黄酮提取工艺
作者：邱建平, 邓 赟, 彭 腾, 陈荟旭, 李鸿翔 作者单位：(成都中医药大学药学院中药材标准化教育部重点实验室,四川 成都 610075)
【摘要】 目的 研究钟花报春花总黄酮最佳提取工艺条件。方法 采用正交试验设计研究不同浓度的乙醇、溶媒体积和提取次数对钟花报春花总黄酮回流提取的影响;采用紫外分光光度法测定提取物中总黄酮含量。结果钟花报春花总黄酮最佳提取条件为60%乙醇,20倍量,提取3次。结论 该方法简便、快速、准确,适用于该药材总黄酮的提取工艺研究。
【关键词】 正交试验; 钟花报春花; 总黄酮; 提取工艺
Optimal extraction of total flavones in Primula sikkmensis Hook by orthogonal design
QIU Jianping,DENG Yun,PENG Teng,CHEN Huixu,LI HONGxiang
(Key Laboratory of Education Ministry for Chinese Crude Drug Standardization,College of Pharmaceutical Sciences,Chengdu University of TCM,Chengdu 610075,China)
【Abstract】 Objective To optimize and establish the extraction of total flavones in Primula sikkmensis Hook.Methods The orthogohal design was used to test the effect of ethanol concentration,solvent volume and extraction times on reflux extraction of total flavones;the content of total flavones was determined by UV methods.Results The optimal extraction condition of total flavones in Primula sikkmensis Hook was extracting with 20 times volume of sample weight with 60% alcohol for three times.Conclusion This method is simple,rapid,accurate and applicable to the extraction process of total flavones in Primula sikkmensis Hook.
【Key words】 orthogonal test;Primula sikkmensis Hook;total flavones;extraction
钟花报春花为报春花科植物钟花报春花(Primula sikkmensis Hook)的干燥花,是一种常见的藏药材[1]，其花黄色,钟状,聚生于花葶顶端。钟花报春花分布于尼泊尔、锡金、不丹、缅甸[2],主产于西藏东部及南部、青海东南部、四川西部、云南西北部。钟花报春花有清热解毒的功效,主治心脉瘀阻、血脉不畅等疾病。国内对报春花属植物的研究主要集中在报春花的化学成分研究、系统分类、地理分布及资源调查等方面[35],而对该植物的黄酮类成分提取工艺研究未见报道。本实验首次采用紫外可见分光光度法对钟花报春花的黄酮类成分的提取工艺进行了研究和优化。
1 仪器与材料
PerkinElmer UV2500型紫外可见分光光度计及相应工作站(美国);超声波清洗仪[必能信超声(上海)有限公司];R201旋转蒸发器(上海申顺生物科技有限公司);PAG160A电子天平(瑞士);芦丁对照品(中国药品生物制品检定所,批号为10080200707);所用试剂均为化学纯或分析纯;实验用水为蒸馏水。钟花报春花采自四川小金县,样品经重庆中药研究所涂永勤博士鉴定。
2 总黄酮含量测定方法学研究
2.1 对照品溶液的制备
精密称取芦丁对照品0.01006 g,置于50 ml容量瓶中,加60%乙醇适量,超声使其溶解,放冷,以60%乙醇稀释至刻度,摇匀,即得0.2012 mg/ml的对照品溶液。
2.2 供试品溶液的制备
精密称取30 ℃下干燥的钟花报春花粗粉2.0001 g,置于100 ml圆底烧瓶中,加入60%乙醇40 ml浸泡药材30 min,于水浴上微沸回流提取1 h,趁热抽滤,滤渣再加60%乙醇40 ml,同法回流提取2次,每次1 h,趁热抽滤,合并滤液,减压回收溶剂,浸膏减压干燥至恒重。将浸膏转移至50 ml容量瓶中,加60%乙醇定容,精密移取25 ml于100 ml容量瓶中,加60%乙醇定容,即制得供试品溶液。
2.3 测定波长的选择
精密量取对照品溶液7 ml,置于25 ml容量瓶中,加入60%乙醇稀释至7 ml,混匀,加5%亚硝酸钠溶液1 ml,摇匀,放置 6 min,加10%硝酸铝溶液1 ml,摇匀,放置6 min,加入氢氧化钠溶液10 ml,再加入60%乙醇至刻度,摇匀,放置15 min,以相应试剂为空白,在200～800 nm进行扫描,测得对照品的最大吸收波长为506.51 nm,因此确定506 nm为测定波长。
2.4 标准曲线的制备
精密量取对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0 、5.0 、6.0、7.0 ml,分别置于7支25 ml容量瓶中,加60%乙醇稀释至7.0 ml,加5%亚硝酸钠溶液1.0 ml,摇匀,放置6 min,再加10%硝酸铝溶液1.0 ml,摇匀,放置6 min,加氢氧化钠试液10 ml,再加60%乙醇至刻度,摇匀,放置15 min,以相应试剂为空白,在506 nm处测定吸光度,结果见表1.以吸光度(A)为纵坐标,浓度(C)为横坐标,绘制标准曲线,见图1,其回归方程为:A=12.785C-0.001,R=0.9996.结果表明浓度在0.008048～0.056336 mg/ml范围内线性关系良好。
2.5 精密度实验
精密量取对照品溶液4 ml,按照标准曲线项下操作,于506 nm波长处连续测定吸光度5次。结果显示:RSD为0.43%(n=5),表明精密度良好。
2.6 稳定性实验
精密量取供试品溶液4 ml,按照标准曲线项下操作,于0、15、30、45、60 min时分别测定吸光度。结果显示:RSD为1.26%(n=5),表明芦丁与铝离子形成的红色络合物在60 min内稳定。
2.7 重复性实验
精密称取药材样品2 g,共5份,按1.2.2项方法制备供试品溶液,按照标准曲线项下操作,于506 nm波长处分别测定吸光度。结果显示:RSD为1.37%,表明重复性良好。
2.8 加样回收率实验
取已知含量的样品6份,分别精密加入一定量的芦丁对照品,照前述拟定的供试品制备方法制备加样回收供试品溶液,于506 nm波长处分别测定吸光度。结果加样回收率平均值为97.25,RSD为1.79%,因此,此方法可很好地用于钟花报春花总黄酮含量的测定。
3 钟花报春花总黄酮提取工艺研究
3.1 正交设计提取因素与水平
在考察单因素影响的预试验的基础上,选择乙醇作为提取溶剂,以乙醇浓度、溶媒体积、提取次数为考察因素,各因素设定3个水平,见表1.
3.2 正交试验结果与分析
用L9(34)正交表进行试验设计优选,结果见表2,方差分析见表3.
通过对测定结果进行直观分析可知,因素影响的显著性依次为:C>A>B。方差分析可知,乙醇浓度A和提取次数C对钟花报春花总黄酮的提取有显著性影响,溶媒体积对总黄酮的提取没有太大的影响。结合实际情况综合分析,最佳的提取工艺条件为A2B2C3,即60%乙醇,加20倍量溶媒,回流提取3次。表1 因素与水平表表2 L9(34)正交试验结果表3 方差分析结果
3.3 验证试验
为进一步考察优化工艺的可靠性,取3份药材,每份2 g,按上述最佳提取工艺进行验证试验,操作方法同上,测定结果见表4.表4 正交试验结果
4 结果与讨论
从正交试验各样品测得的总黄酮的含量来看,影响提取效率的主要因素为乙醇浓度和提取次数,综合考虑后确定最佳提取条件为60%乙醇,20倍量,回流提取3次,每次1 h,所得黄酮含量最高。
采用60%乙醇回流提取,提取物中除总黄酮外,还含有其它成分,如需提高提取物中总黄酮含量,可采用大孔树脂进行富集纯化。初步试验结果表明,使用D101大孔树脂可使干浸膏中总黄酮含量达到45%.不同型号的大孔树脂对富集纯化钟花报春花总黄酮能力的考察还有待进一步研究。
【参考文献】
[1] 帝玛尔.丹增彭措.晶珠本草[M].上海:上海科学出版社,1980:320.
[2] 胡启明.中国植物志第59卷第2分册1[M].北京:科学出版社,1990:136138.
[3] 彭腾,涂永勤,邓贇,等.钟花报春花的化学成分研究[J].中药材,2008,(31)1:4446.
[4] 王凤英,葛学军,郝刚,等.喜马拉雅横断山区钟花报春居群遗传多样性及遗传多样性遗传分化[J].热带亚热带植物学报,2005,13(2):149153.
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