组胺H4受体在变应性鼻炎中的表达及临床意义
作者：彭 华1,2, 卢汉桂1, 姜鸿彦1, 林志斌1, 陈彦球1, 陈德华1, 李添应1 作者单位：1. 中山大学附属第一医院耳鼻咽喉科, 广东 广州 510080; 2. 广州军区广州总医院耳鼻咽喉科, 广东 广州 510010
【摘要】 【目的】 探讨新型组胺H4受体(H4R)在变应性鼻炎(AR)中的表达及临床意义。【方法】 变应性鼻炎(AR)组73例,正常对照(N)组30例,用Western蛋白印迹法(Western blot)及实时定量荧光聚合酶链反应(Real-time PCR)检测两组对象外周血单个核细胞(PBMC)中H4R的蛋白及基因表达。用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测AR组患者外周血血清白细胞介素4(IL-4)及白细胞介素12(IL-12)的含量,分析H4R mRNA表达含量与IL-4。IL-12以及二者比值的关系。【结果】 AR患者PBMC中H4R的蛋白表达和mRNA表达都显著高于正常对照组。AR患者H4R的mRNA表达量与IL-4的表达呈正相关(r = 0.71,P < 0.01),与IL-12的表达呈负相关(r = -0.50,P < 0.01),与IL-4/IL-12比值亦有显著的相关性(r = 0.75,P < 0.01)。【结论】 H4R的表达与AR的发病有相关关系,AR患者H4R的表达升高可能参与了Th1/Th2平衡失调的免疫过程。
【关键词】 组胺H4受体; 变应性鼻炎; IL-4; IL-12
中图分类号: R76 文献标志码: A 文章编号: 1672-3554(2010)02-0195-04
Expression of Histamine H4 Receptor in Allergic Rhinitis and Its Clinical Significance
PENG Hua1,2, LU Han-gui1, JIANG Hong-yan1, LIN Zhi-bin1, CHEN Yan-qiu1, CHEN De-hua1, LI Tian-ying1
1. Department of Otorhinolarygology, The First Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, China;
2. Department of Otorhinolarygology, The General Hospital of Guangzhou Military Command, Guangzhou 510010, China
Abstract: 【Objective】 This study was designed to discover the expression of histamine H4 receptor in allergic rhinitis(AR) and its clinical significance. 【Methods】 Seventy-three patients with allergic rhinitis and 30 volunteers were recruited in our study. Western blot and Real-time fluorescent quantification PCR were used to detect the protein and mRNA expression of H4R on peripheral blood monocytes (PBMC). To analyze the relationship between the H4R and allergic rhinitis, the level of serum interleukin 4 (IL-4) and interleukin 12 (IL-12) were determined by enzyme linked immunosorbnent assay (ELISA) in the AR group. 【Results】 The protein and mRNA expression of H4R in the AR group were significantly higher than that in the NAR group. Person correlation analysis revealed that H4R was positively correlated with IL-4 (r = 0.71, P < 0.01) and negatively correlated with IL-12 (r = -0.50, P < 0.01). The expression of H4R also had positive relationship with IL-4/IL-12 ratio (r = 0.75, P < 0.01). 【Conclusion】 These results indicate that histamine H4 receptor is closely related with allergic rhinitis and is important in the pathogenesis of AR. The elevated expression of H4R in AR patients’ PBMC may be closely correlated with Th1/Th2 balance.
Key words: histamine H4 receptor; allergic rhinitis; interleukin 4; interleukin 12
[J SUN Yat-sen Univ(Med Sci),2010,31(2):195-198;206]
组胺是导致变应性鼻炎(allergic rhinitis, AR)发生的最重要介质之一,其作用包括通过直接炎症作用及免疫调节作用[1]。近年来的研究发现了一种新型的组胺受体——组胺H4受体(histamine H4 receptor, H4R),它特异性地表达在肥大细胞。嗜酸性粒细胞。树突状细胞。T细胞等免疫细胞的膜表面,而且对这些细胞起着免疫调节的作用。H4R及其特异性拮抗剂的研究让人们重新思考和评估组胺在体内介导炎症和免疫反应的途径。在I型变态反应中组胺除通过H1受体介导过敏反应外,是否也通过H4R起着重要的免疫调节作用成为近年来的研究热点。本研究通过Western蛋白免疫印迹法。实时定量荧光PCR检测了AR患者PBMC中H4R的表达,并用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbnent assay, ELISA)检测外周血血清中白细胞介素4(interleukin 4, IL-4)。白细胞介素12(interleukin 12, IL-12)的含量,探讨H4R在AR发病中的作用以及与Th细胞因子表达的相关性。
1 材料与方法
1.1 研究对象
1.1.1 入选标准 ①AR组73例AR患者为2008年6月 - 2008年12月在我科门诊就诊病人,年龄18岁以上,均符合中华耳鼻咽喉科学会2005年修订的关于变应性鼻炎的兰州标准[2]以及符合WHO制定的ARIA2007诊断标准[3]。所有患者均有典型的AR的症状及体征,且皮肤过敏原检测及特异性IgE检测(瑞典法玛西亚公司UniCAP100全自动体外免疫诊断系统检测)均有1个以上的吸入性过敏原阳性。②正常对照组(缩写为N组)为同期选择的30例在校大学生。NAR组对象无上述过敏症状,无其他过敏性疾病,皮肤过敏原检测及特异性IgE检测均为阴性。③本研究通过中山大学附属第一医院伦理委员会的批准,研究对象知情同意。
1.1.2 排除标准 所有入选者均排除以下情况:妊娠及哺乳期妇女;2个月内应用糖皮质激素和抗组胺治疗者;正在罹患上和/或下呼吸道感染者;全身患有主要组织器官疾病者。
1.2 主要试剂
细胞蛋白提取试剂盒购自Qcbio公司,TRIzol isolation Reagent购自Invitrogen公司,PCR引物由Invitrogen公司合成。兔抗人H4R多抗购自Chemicon公司,IL-4及IL-12p70 ELISA试剂盒购自R&D公司。
1.3 标本的采集及制备
两组人群均抽取外周静脉血4 mL,EDTA抗凝管,分两管抽取,抽取2 h内用密度梯度离心法分离并提取外周血单个核细胞(peripheral blood monocytes, PBMC),直接保存于-80 ℃冰箱, AR组患者另抽取2 mL静脉血,分离血清。
1.4 观察指标
1.4.1 Western blot测定PBMC中H4R的蛋白表达 用蛋白提取试剂盒裂解细胞,提取蛋白裂解液。蛋白定量后,按每孔30 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳,完毕后用电印迹转移法转至硝酸纤维素膜上。转膜结束后,硝酸纤维素膜于50 mL/L的脱脂牛奶封闭液中室温封闭1 h,加入一抗工作液兔抗人H4R抗体37 ℃孵育2 h,洗膜后加入HRP标记的二抗工作液羊抗兔GAPDH,37 ℃孵育1 h。洗膜后ECL发光压片显色。
1.4.2 荧光实时定量 PCR测定PBMC中H4R的mRNA表达 Trizol一步法提取细胞总RNA,异丙醇法浓缩RNA,分光光度计测定总RNA的纯度,甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的质量。用逆转录试剂核逆转录合成cDNA后,再用ABI PRISM。誖7300型定量PCR仪进行定量PCR检测。相应的引物见表1。PCR反应条件:95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s,72 ℃ 30 s,共40个循环。用GAPDH 基因为内参基因。样品目的基因的相对表达率(relative expression, RQ)采用ΔΔCt方法计算,RQ = 2-ΔΔCt(Ct表示反应时的实时荧光强度显著大于背景值时的循环数,ΔΔCt = 目的基因Ct - 内参Ct,无参照样品则选择ΔCt最大的样品为参照进行计算,ΔΔCt = 待测样品中目的基因ΔCt - 参照样品中目的基因ΔCt)。
1.4.3 ELISA测定AR组外周血血清IL-4。IL-12
采静脉血高速离心后取血清,按说明书步骤采用双抗体夹心ELISA方法测定AR组外周血血清IL-4。IL-12。
1.5 统计学分析
数据以均数 ± 标准差表示(x ± s),采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析,两组均数的比较采用t检验,P < 0.05为有统计学意义。PBMC的H4R mRNA表达与血清IL-4。IL-12的相关性采用Person相关分析。
2 结 果
2.1 Western blot检测PBMC H4R表达结果
Western blot检测发现两组人群PBMC H4R蛋白表达存在明显的差异,如图1。H4R在正常人群H4R的表达较低(0.04 ± 0.17),而在AR患者PBMC中呈高表达(0.98 ± 0.41),二者差异具有显著性(P = 0.007,n = 24,两组各12例)。
2.2 定量PCR检测结果
采用实时定量荧光PCR检测两组人群PBMC中H4R mRNA的表达水平发现,AR组PBMC的H4R mRNA的表达为47.3 ± 45.3,明显高于正常对照组13.0 ± 21.0(P = 0.001,图2)。
2.3 血清IL-4。IL-12检测结果及与H4R的相关性分析
73例AR患者外周血血清中,IL-4和IL-12的含量分别为(7.1 ± 5.0) pg/mL和(45.1 ± 40.1)pg/mL。AR患者PBMC中H4R mRNA表达含量与血清IL-4。IL-12的相关性分析结果提示:H4R mRNA与IL-4蛋白表达存在正相关(r = 0.71,P < 0.01),与IL-12蛋白表达存在负相关(r = -0.50, P < 0.01),H4R mRNA与IL-4/IL-12的比值亦有明显的相关性(r = 0.75,P < 0.01)。
3 讨 论
AR是外界变应原导致的鼻黏膜的慢性炎症反应。目前认为其发病机制主要为IgE介导的多种细胞因子及炎症介质参与的I型变态反应。Th1/Th2细胞因子平衡失调,其平衡向着Th2型偏移是其重要因素。组胺是AR过敏反应的核心介质,它通过与胞膜上特异性受体的“钥-锁”关系结合后,参与对血管平滑肌及血管内皮细胞的直接作用以及对错综的细胞因子网络调节作用,从而推动着AR的发生发展。传统的观念认为组胺是通过其H1受体实现上述过敏反应的病理过程。然而临床抗组胺H1受体的治疗的疗效与组胺在过敏反应中的显著作用存在明显的差异,提示组胺可能也同时通过非H1受体的途径参与变态反应。
组胺H4R属于G蛋白偶联受体超家族成员,主要表达在一些造血来源的细胞,目前已知的有功能性H4R表达的血细胞种类有:肥大细胞。嗜酸性粒细胞。嗜碱性粒细胞。树突状细胞。T细胞。以及单核细胞[4]。Ling等人[5]报道,组胺通过H4R诱导了嗜酸性阳离子蛋白及嗜酸细胞活化趋化因子3的产生,从而明显增强了嗜酸性粒细胞的趋化作用,同时还导致了嗜酸性粒细胞肌动蛋白聚合作用增强。细胞形状改变,以及上调其黏附因子Mac-1及ICAM-1的表达。体外实验发现,活化的肥大细胞上的H4R能使基质细胞衍生因子CXCL12明显增加,从而促进B细胞的分化和成熟[6]。在体内,组胺通过H4R介导肥大细胞。嗜酸性粒细胞。树突状细胞以及单核细胞的趋化作用,哮喘急性期气道黏膜下肥大细胞及嗜酸性粒细胞浸润明显增多。对哮喘的研究还发现,组胺对树突状细胞的分化调节有H1R和H4R两条途径。H4R的活化可以抑制了单核细胞来源的树突状细胞产生IL-12p70,并能增加IL-4。IL-10。IL-16等细胞因子和增加细胞表面黏附分子,如CCL17。CCL22。CCL2的表达,是Th细胞发生Th2型偏移的关键[7]。近来Takahashi观察了H4R的特异性拮抗剂JNJ7777120对AR小鼠鼻炎症状及总IgE的影响,发现H4R的拮抗剂可明显控制模型小鼠的过敏症状。降低总IgE的水平,并导致了IL-4水平显著降低及IFN-γ水平显著升高。这些说明H4R在I型变态反应中起着免疫调节的作用,同时也表明上下呼吸道变应性炎症的调节机制具有相关性。
本研究中我们采用Western蛋白免疫印迹及实时定量荧光PCR分别从蛋白水平和mRNA水平证实了H4R在AR患者PBMC中表达增高,表明H4R与AR的发病相关。组胺在体内具有作为炎症介质直接介导过敏反应及在过敏反应中起免疫调节的双重作用。目前已有研究认为,H4R可能参与了组胺在过敏性炎症中的调节作用[8]。因此,H4R也可能与H1受体共同介导了组胺对AR的病理反应过程。我们的结果还证实:相对于正常人,AR患者H4R mRNA水平的变化与蛋白水平的变化一致,均为高于正常对照人群。而H4R mRNA的增高与血清IL-4的增高呈正相关,与血清IL-12的表达则呈负相关,与IL-4/IL-12的比值亦有明显的相关性。IL-4是Ⅱ型辅助T细胞(Th2细胞)分泌的细胞因子。白细胞介素-4的生物作用,包括刺激活化B细胞。刺激T细胞增殖及CD4+T细胞分化成Ⅱ型辅助T细胞。诱导B细胞抗体类别向IgE转换,上调第二型主要组织兼容性复合体的产生等。因此,IL-4被认为是Th2型代表性细胞因子。而IL-12可直接抑制Th2型细胞因子IL-4。IL-5。IL-10的产生,并促进Th1型细胞因子IFN-γ。IL-2等的产生,同时增加抗原特异性T细胞的数量,被认为是促使Th1/Th2向Th1偏移的始动细胞因子[9]。H4R主要表达于外周血的免疫细胞上且与IL-4及IL-12的水平以及其比值具有相关性,这些表明H4R可能参与了Th1/Th2的平衡调节,从而在AR的发病机制中起着免疫调节的作用。鉴于此,我们认为H4R可能可以作为AR治疗研究中的一个新的重要治疗靶点,阻断H4R的功能将有助于进一步阻断组胺在AR中的作用。
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