重组腺病毒载体Ad-LMP-1的构建及其转染MSC后成骨活性

　作者：程志安1, 刘冬斌3, 吴燕峰2, 黄 霖2, 沈慧勇2, 刘尚礼2 作者单位：1. 广州中医药大学第二附属医院∥广东省中医院骨科, 广东 广州 510120;2. 中山大学附属第二医院骨科, 广东 广州 510120; 3. 佛山市南海区人民医院骨科, 广东 佛山 528200

　　【摘要】 【目的】 快速构建大鼠LIM矿化蛋白-1基因重组腺病毒载体,转染MSC,探讨LMP-1基因对MSC成骨分化和成骨活性的影响。 【方法】 从大鼠成骨细胞内提取总RNA,并设计LMP-1特异性引物进行RT-PCR,获取LMP-1基因后利用Invitrogen公司的TOPO定向克隆技术创建入门克隆pENTR/D-LMP-1。转化TOP10细菌后,挑取阳性克隆摇菌提取质粒,入门克隆再与表达载体pAD/CMV/V5-DEST进行同源重组反应得到病毒载体pAD/CMV/V5-LMP-1,转化细菌后挑选阳性克隆摇菌提取重组病毒质粒,用PacI内切酶线性化后用转染293A细胞后得到重组腺病毒载体。以腺病毒为载体,将大鼠LMP-1基因体外转染于3代大鼠MSC细胞内,检测LMP-1基因在MSC细胞的表达,分别观察转染后实验组与对照组I型胶原。碱性磷酸酶。骨钙素表达变化以及骨钙结节的形成情况,评价LMP-1基因的成骨能力。【结果】 成功获取大鼠LMP-1基因,入门质粒与病毒表达质粒经过酶切鉴定以及测序验证。LMP-1基因能在MSC中高效表达,转然后MSC的I型胶原,碱性磷酸酶。骨钙素的表达明显增强,骨钙结节形成增多。 【结论】 利用Gateway 技术构建LMP-1重组腺病毒载体相对简单,可快捷获得的pAd-LMP-1。pAd-LMP-1转染MSC后,LMP-1基因能促进MSC向成骨细胞分化,增强其成骨作用。

　　【关键词】 LIM-1矿化蛋白; 间充质干细胞; 成骨活性; 基因转染

　　中图分类号: R329.2+8 文献标志码: A 文章编号: 1672-3554(2010)02-0199-07

　　Osteogenic Activity of MSC Infected by Recombinant Adenovirus Vector Ad-LMP-1

　　CHENG Zhi-an1, LIU Dong-bin3, WU Yan-feng2, HUANG Lin2, SHEN Hui-yong2, LIU Shang-li2

　　1. Department of Orthopaedices, The Second Affiliated Hospital of Guangzhou Chinese Medicine University　Guangdong Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine), Guangzhou 510120, China;2. Department of Orthopaedics, The Second Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510120, China;3. Department of Orthopadics, The People’s Hospital of Nanhai District, Foshan 528200, China

　　Abstract: 【Objective】 This study was designed to construct a recombinant adenovirus vector contains LMP-1 gene,and investigate the osteoinductive activity of MSC which were transfected recombinated adenoviral vector carrying LMP-1 gene. 【Methods】 Total RNA was extracted from rat osteoblast and the LMP-1 gene was acquired by RT-PCR, the LMP-1 gene and entry vector pENTR/D-TOPO were used to create the entry clone with the directional TOPO clone technology, then the entry clone and the expression vector were used to create the expression clone through the LR recombination reaction. The adenovirus expression clone was linearized by PacI and transfected to the 293A cell line to harvest a high titer. Ad-LMP-1 was infected into the 3rd passage MSC, the expression of LMP-1 was detected by Western blot. The osteogenic activity of MSC was evaluated by the expression of collagen I, ALP, osteocalcin and the formation of bone nodule. 【Result】 The LMP-1 gene was successfully acquired and confirmed, the entry clone and the expression clone were both verified by enzymes digestion, and the expression clone was further confirmed by sequenced. The expression of LMP-1 was detected successfully in MSC. The increasing expression of collagen I, osteocalcin, ALP and bone nodule were observed by comparing to the control group. 【Conclusion】 Gateway technology not only LIM　make construction of the pAd-LMP-1 recombination adenovirus vector simple and fast, but also get a high transfection efficacy in MSC. LMP-1 gene can induce the osteoblast differention of MSCs, and improve its osteogenic activity. The adenovirus vector is reliable to be used in further gene therapy research.

　　Key words: LIM mineralization protein-1; mesenchymal stem cells; osteogenic activity; gene transfect

　　[J SUN Yat-sen Univ(Med Sci),2010,31(2):199-206]

　　矿化蛋白-1(LIM mineralization protein-1, LMP-1)是直接参与成骨分化的细胞内因子,它的成骨作用可能表现在参与合成和分泌其他的成骨诱导蛋白如骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMP)以及转化生长因子子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1),同时招募附近的细胞分化直接参与骨膜或软骨内成骨。在动物或体外实验中,小剂量的含LMP-1基因的腺病毒或质粒载体转染骨髓基质细胞,可持续稳定地诱导骨形成[1]。LMP-1的高效骨诱导特性为治疗骨质疏松性骨折提供了新的选择。本研究用Gateway技术构建LMP-1重组腺病毒载体,以腺病毒为载体,将LMP-1基因导入间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC),通过比较实验组与对照组中MSC成骨活性的差异,来进一步验证LMP-1的骨诱导作用,为后续的LMP-1基因治疗骨质疏松及其骨折研究奠定基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂

　　新生牛血清购于杭州四季青生物;低糖DMEM培养基购于Gibco公司;Ⅰ型胶原酶。Ⅱ型胶原酶购于Sigma公司;Trizol。DEPC 。RT-PCR试剂盒。Pfu高保真聚合酶。琼脂糖。DNA回收试剂盒。DNA标准Marker。质粒小提试剂盒。病毒DNA提取试剂盒均购于Takara(大连)公司;入门载体试剂盒(含TOP10感受态菌)。表达载体pAD/CMV/V5-DEST(含293A细胞)。LR ClonaseTM 酶购于Invitrogen公司;内切酶NotⅠ。AscⅠ。PacⅠ均购于NEB公司。MSC诱导药物地塞米松。胰岛素。β磷酸甘油。IBMX。维生素C。吲哚美辛购于Sigma公司,染色试剂油红O。茜素红购于AMRESCO公司,免疫组化用一抗兔抗大鼠Ⅰ型胶原,兔抗大鼠骨钙素。二抗羊抗兔IgG及 SABC试剂盒均购于武汉博士德公司;兔抗大鼠LMP-1抗体购于美国Santa Cruze公司;碱性磷酸酶Elisa检测试剂盒。骨钙素Elisa检测试剂盒均购于武汉华美生物公司。

　　1.2 大鼠LMP-1基因的获取

　　1.2.1 大鼠成骨细胞的分离与体外培养以及鉴定

　　取SD乳鼠两只放入750 mL/L酒精中浸泡10 min。无菌取颅盖骨,置于含PBS液的培养皿中,尽量剔除附着的血管及结缔组织,PBS液清洗,再将颅盖骨剪成1 mm × 1 mm碎块,转移到50 mL离心管中,1 g/L胶原酶(Ⅰ型:Ⅱ型 = 1:6)消化液37 ℃水浴消化20 min,并每隔2 min摇晃震荡一次,共消化4次,分别取后两次消化液转移至15 mL离心管予以250 × g离心10 min,弃去上清液,沉淀即为成骨细胞,用含100 mL/L新生牛血清的L-DMEM培养液重悬,吹打均匀至单个悬细胞,按1 × 105/mL密度接种到25 cm2培养瓶中,37 ℃。50 mL/L CO2。饱和湿度下培养,传代。

　　1.2.2 大鼠成骨细胞总RNA的提取 取2代大鼠成骨细胞将培养液换成含1 nmol/L地塞米松和100 mL/L胎牛血清培养液(L-DMEM)诱导培养一周[1],当细胞融合近90%后,吸弃培养液,PBS冲洗两次,按照Trizol説明书进行细胞RNA提取,每只25 cm2 中加入Trizol液1 mL,最终所得的RNA利用30 μL的DEPC水溶解,并对其进行琼脂糖凝胶电泳和分光光度检测,其余的RNA置于 -80 ℃冰箱保存。按D(260) = 1的RNA溶液每mL约含40 μg RNA来估算所得到RNA的浓度,根据在260 nm以及在280 nm的读数间的比值D(260)/D(280)估计核酸的纯度。

　　1.2.3 RT-PCR获取与扩增LMP-1基因 RT-PCR利用TAKARA RT-PCR试剂盒进行两步法反应:第一步反应体系选用Oligo引物,按照试剂盒説明书依次加入反应体系于100 μL PCR管中,置于PCR仪中45 ℃,25 min,然后95 ℃,10 s使逆转录酶变性,得到的cDNA用于PCR,剩余可保存于 -20 ℃。第二链合成中引物根据Genebank中大鼠LMP-1基因利用Primer 5软件设计而成:正义引物:5′-CACC ATGGATTCCTTCAAGGTAGTGC-3′,反义引物:5′-GGGCTTGTCCTTCTTGGAGTAG-3′,其中CACC是目的基因与入门载体之间的接头,并且框中结构形成Kozak序列,有助于增强目的基因的表达[2],预计合成1 341 bp的产物。大鼠GAPDH内参引物:正义:5′-CAGTGCCAGCCTCG TCTCAT-3′,反义:5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′,预计合成571 bp的产物。聚合酶采用TAKARA高保真酶,采用50 μL反应体系进行30个循环反应(98 ℃,10 s;56 ℃,10 s;72 ℃,1 min 25 s),最后延伸7 min后收集产物进行电泳鉴定,并利用DNA凝胶回收试剂盒进行纯化回收,测D值进行浓度分析。

　　1.3 LMP-1重组腺病毒载体的构建

　　1.3.1 LMP-1与入门载体pTREN-TOPO构建入门克隆 根据纯化目的基因的浓度进行6 μL的TOPO反应体系:PCR纯化产物0.5 μL。盐溶液1 μL。入门载体1 μL。无菌水3.5 μL,轻轻混匀,室温(约25 ℃)静置5 min后冰浴10 min,取2 μL TOPO反应产物进行转化TOP10感受态大肠杆菌,最后涂在含有50 μg/mL卡那霉素的LB平板进行筛选,平板置于37 ℃恒温培养箱16 ~ 24 h后观察阳性克隆。无菌操作下挑取单个阳性克隆置于含50 μg/mL卡那霉素的LB培养基4 mL置于37 ℃,水平转速为250 r/min的恒温摇床摇菌8 h,按照质粒提取试剂盒説明操作进行质粒提取,并对提取的质粒分别进行NotⅠ。AscⅠ单酶切和双酶切鉴定。

　　1.3.2 入门克隆与表达载体pAd/CMV/DEST-V5同源重组创建表达克隆 根据入门克隆的浓度进行LR重组反应:入门克隆3 μL。表达载体pAd/CMV/DEST-V5 1 μL。TE缓冲液4 μL。LR ClonaseTM 酶2 μL。以上反应体系轻轻混合后置于25 ℃水浴箱过夜,取2 μL反应产物转化TOP10感受态大肠杆菌,最后凃板于含50 μg/mL氨苄青霉素的LB培养板,置于37 ℃培养箱中16 ~ 24 h观察阳性克隆,并挑取单个克隆摇菌,提取质粒,电泳鉴定以及利用目的基因引物进行最后测序。

　　1.4 重组腺病毒载体在293A细胞中的包装与扩增

　　取重组腺病毒质粒约5 μg,用PacⅠ内切酶酶切使之线性化,同时切去质粒的Amp+和Ori位点,暴露病毒的ITRs位点,用7 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切产物。用乙醇沉淀法纯化酶切产物,测D值确定浓度,按照lipofectmin操作程序对90%生长融合的低代293A细胞转染,按lipofectmin(。滋L)/DNA(。滋g)约1:1的比例以及每孔1 ~ 5 。滋L的lipofectmin剃度进行转染,转染8 h后弃转染液,加入新鲜培养液1 mL/孔,在观察出现CPE之前3日换液一次,出现CPE后停止换液。待293A细胞出现100%CPE时利用 -80 ℃,30 ℃各15 min反复冻融3次,吹打离心得到病毒上清。利用第一代病毒上清液250 μL再次感染75 cm2培养瓶中的293A细胞以提高病毒滴度。同时提取病毒DNA进行PCR鉴定: 用TAKARA MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction kit 提取病毒DNA,利用目的基因引物进行PCR 鉴定,确认目的基因包含在病毒载体中。

　　TCID50病毒滴度测定:在96孔板中分8个病毒稀释梯度,每个梯度12孔(一排),其中前2孔为阴性对照,实际每个梯度10孔,加入到20 mL/L胎牛血清培养液(DMEM)的293A细胞中,37 ℃培养箱培养10 d。10 d后倒置显微镜下观察,计算每一排中出现CPE的孔数,根据T = 101+d(S-0.5),最后将TCID50/mL转换为PFU/mL。

　　1.5 大鼠MSC的分离,培养与鉴定

　　取4周龄SD雄性大鼠一只,断颈处死,750 mL/L酒精浸泡10 min,无菌下取双后肢股骨和胫骨,将其附着肌肉和结缔组织分离干净,PBS冲洗,用无菌剪从中间剪短股骨及胫骨,用5 mL注射器注入PBS在断端冲洗骨髓直到骨质变白,冲洗液用2支15 mL离心管收集,250 × g,离心10 min,吸弃滤液,沉淀细胞中加入100 g/L高糖DMEM 10 mL。用吸管吹打至单个悬细胞,接种于2个25 cm2培养瓶中,37 ℃。体积分数为5%CO2饱和湿度的培养箱中培养;3 d后半量换液,6 d后全量换液,10 d后细胞80%汇合,用2.5 mL/L胰蛋白酶消化传代,继续培养。

　　第3代MSC利用流式细胞仪分别对CD29。CD44。CD105阳性,CD45阴性进行检测鉴定;利用第3代MSC进行成脂诱导(含1 μmoL/L地塞米松, Insulin 10 mg/L, IBMX 0.5 mmol/L, Indomethacin 0.2 mmol/L的100 g/L高糖DMEM),成骨诱导(含0.25 mmol/L抗坏血酸。10 mmol/L β-磷酸甘油与10 nmol/L地塞米松的100 g/L高糖DMEM),4周后分别进行油红O,茜素红染色进行鉴定。

　　1.6 试验分组

　　分别根据转染时不同的感染复数(multiplicity of infection, MOI)将试验组分为A。B。C。D 4组(A组MOI = 0.1;B组MOI = 1;C组MOI = 10;D组MOI = 100);对照组:利用Ad-LacZ转染(MOI = 10)作为阳性对照E组,未加病毒转染(MOI = 0)作为阴性对照F组;每一个实验组用12孔(两个6孔板)进行试验观察。

　　1.7 转染过程

　　将第3代MSC传代与12个6孔板中(5 × 104 cells/孔),标记各板,24 h完全贴壁后各板各孔按原计划计算加入病毒液量,轻轻平摇1 min, 使病毒液与培养基均匀混合,放回培养箱继续培养,12 h后弃培养基,换新鲜培养基。3 d后换液,每孔加入新鲜培养基1 mL,7 d后换液,同时保留培养液用于检测。10 d后再次换液,14 d后再次换液,保留培养液用于检测。

　　1.8 培养液碱性磷酸酶活性。骨钙素含量的检测

　　操作方法按试剂盒説明书,同时利用考马斯兰法测定培养液培养液中蛋白的含量,将碱性磷酸酶活性换算成u/mg。

　　1.9 免疫组化检测Ⅰ型胶原蛋白,骨钙素,以及骨钙结节的检测

　　利用盖玻片置于六孔板中便于细胞爬片,转染2周后取出玻片,按免疫组化试剂盒説明书进行相关步骤操作。3周后进行茜素红染色,观察骨钙结节形成情况。

　　1.10 Western-blot检测LMP-1基因在MSC中的表达情况

　　转染48 h后利用细胞裂解液冰上裂解细胞,收集蛋白进行SDS-PAGE电泳;经过转膜,一抗二抗孵育以及显色反应,摄片观察保存。

　　1.11 统计学处理

　　试验数据采用x ± s表示,利用SAS8.1统计学软件进行统计处理,组间差异利用方差分析,组间两两比较采用SNK统计。

　　2 结 果

　　2.1 成骨细胞的分离。培养和初步鉴定

　　成骨细胞接种后24 h后即可见大量贴壁细胞,细胞呈长梭型,多角形或不规则型,48 h后可见细胞融合70% ~ 80%。

　　2.2 成骨细胞的总RNA提取

　　总RNA后电泳结果显示:可见18S和28S两条条带,亮度28S:18S ≈ 2:1,初步表示所提RNA完整。分光度测定结果:D(260) = O.473,D(280)= 0.233,D(260)/D(280) = 2.03,表示所提RNA纯度符合要求(图1A)。

　　2.3 RT-PCR获取与扩增LMP-1基因

　　取目的与内参PCR产物各5 。滋L进行电泳(图1B)。

　　2.4 入门克隆的酶切鉴定

　　入门克隆的酶切鉴定结果见图2。

　　2.5 病毒质粒载体与测序结果

　　病毒表达质粒送于上海英俊生物公司测序,并与Genebank中LMP-1(基因号:AF095585)做BLAST比较,发现系列一致,没有突变。

　　2.6 病毒载体在293A细胞中的包装

　　按照前述条件转染,8 d后293A细胞出现约100%CPE(细胞病毒效应),细胞感染病毒后,用病毒上清提取病毒DNA为模板,以前述目的基因引物为引物作PCR检测,电泳可检测出目的条带,説明病毒液中含有目的基因(图3)。

　　2.7 全骨髓细胞培养

　　3 d后可见少量长梭形贴壁细胞,半量换液,1周后可见MSC贴壁集落形成,细胞疏密不均,9 d后予以传代,第2代MSC呈长梭形。纺锤形生长,形态仍不均1,3代MSC呈长梭形,漩涡状生长,形态较为均一。将第3代MSC进行成骨成脂诱导4周后进行茜素红以及油红O染色,分别可见矿化结节以及脂滴阳性显色。将第3代MSC进行流式细胞仪检测,可见CD29+ 约96.27%;CD44+ 约99.51%;CD105+ 约90.38%;CD45- 约96.08%。

　　2.8 转染后培养液中碱性磷酸酶测定

　　分别收集转染1周后,2周后各组各孔的培养液,利用ELISA方法测定ALP含量,发现个转染组在1周末,2周末的ALP,含量均高于对照组,经过方差分析统计比较,F值分别为:106.19和9.92,均P < 0.01,差异具有统计学意义;SNK两两比较,发现除E组,F组差异比较没有统计学意义,其余各组相互比较均具有统计学意义,即表明当转染MOI = 10具有最强的诱导碱性磷酸酶活性作用。

　　2.9 转染后骨钙素的测定

　　收集各组各孔1周后,2周后的培养液,利用ELISA法测定骨钙素含量,发现各组比较情况与ALP类似,方差分析结果,F值分别为:114.88和193.15,均P < 0.001,各组差异具有统计学意义;两两比较,E组,F组,以及两周末的B组与D组差异比较没有统计学意义,其余各组相互比较均具有统计学意义,表明转染MOI = 10时具有最强的诱导骨钙素表达作用,与上述碱性磷酸酶一致(表1,2)。

　　2.10 免疫组化

　　显示转染2周后组骨钙素,Ⅰ型胶原的表达明显高于对照组,3周后茜素红染色显示矿化结节染色明显,结果显示见图5 A-D。

　　2.11 Western-blot检测

　　LMP-1基因在MSC中的表达,可见转染组表达的浓度显著高于对照组(图6)。

　　3 讨 论

　　由于骨质疏松(osteoporosis, OP)患者成骨能力低下,骨折手术失败率高,愈合缓慢甚至不愈合[2],OP骨折的治疗多年以来一直是困绕骨科临床医生的难题之一。基因治疗骨质疏松骨折目前仍是一个有待开垦的崭新领域。MSC的生物学特性表明它能作为基因治疗理想的靶细胞和载体,LMP-1作为细胞内的蛋白不仅能高效地诱导骨的形成,更能刺激多种骨诱导因子(包括BMPs。TGF-β1等)的分泌,为骨折的修复提供非常有利的环境。因此选择LMP-1作为载体,以MSC作为基因治疗的靶细胞,LMP-1 cDNA转染MSC,促进MSC增殖和成骨细胞分化,提高MSC的成骨活性,用含LMP-1cDNA的MSC治疗OP骨折。是对基因治疗OP骨折这种新方法和途径的探索。

　　骨诱导因子大多是细胞外分泌型因子,是由细胞外蛋白或是由传递细胞间信号的多肽构成,如BMP等。与BMP不同, LMP-1是细胞内因子,作为细胞内信号分子,它能于体内。体外启动骨的形成。LMP-1不是分泌型因子,它是能刺激其它骨诱导因子合成和分泌的细胞内蛋白。表达LMP-1的细胞能合成和分泌多种不同骨诱导因子(包括BMP。TGF-β1等),同时招募临近的细胞分化并直接参加骨膜或软骨内成骨[1],这样也就为成骨能力低下的疏松骨组织提供了非常有利于骨形成的环境。动物以及体外实验表明,使用非常小剂量的腺病毒或质粒载体转染LMP-1 cDNA的骨髓细胞,能持续高效地诱导骨形成,促进脊柱的融合。CT扫描还显示表达LMP-1细胞的存在增加了融合块的密度并使载体边界有更多的骨形成[3-5]。国内外关于骨诱导因子促进骨形成的大多数研究都集中在BMP上,关于LMP-1的研究相对较少[6]。研究的对象主要为骨缺损的修复以及脊柱的后路融合,途径为转基因技术和重组蛋白应用。研究结果表明,两种方法均能促进骨的形成,但基因治疗较重组蛋白必要时能提供更持续的蛋白释放,而且能以更符合生理要求的方式提供蛋白[7]。重组蛋白诱导的新骨不规则地填充于骨折端的边缘,骨小梁比较脆弱,象壳一样围绕骨缺损处;转基因诱导的新骨为坚实的三维骨小梁结构,并重建形成新的骨皮质[8]。与BMP不同,LMP-1为细胞内信号分子直接刺激成骨细胞的分化,并刺激其它骨诱导因子合成和分泌,因此治疗性应用LMP-1,其基因cDNA的转染是必须的。也是最好的途径[4]。LMP-1在体内外高效的成骨作用是我们选择其作为治疗骨质疏松及其骨折候选基因的主要原因。

　　腺病毒是目前转基因实验研究中使用最多的病毒载体。目前大多采用Adeasy系统来构建和包装腺病毒载体。本试验采用了Invitrogen公司的GatewayTM技术进行病毒载体构建,首先将目的基因进行TOPO定向克隆至入门载体,然后利用入门载体克隆与病毒骨架在体外进行同源重组,将目的基因转入病毒骨架,转化筛选,整个过程只需两步。这项技术的特点是只需设计引物时在目的基因前加上CACC接头,PCR产物即可利用接头与入门载体pENTR/D-TOPO进行TOPO定向克隆,5 min即形成入门克隆,再转化细菌筛选阳性克隆,由于入门载体自身是线性,只有在TOPO克隆成功才能与目的基因连接成环状,完成滚环复制,因此所得阳性克隆特异性高。入门克隆获取后可利用同源位点和表达载体pAD/CMV/V5-DESTTM在体外进行同源重组反应,只需6 ~ 8 h并可转化细菌筛选重组子,同时由于表达载体含有自我死亡基因ccdB,重组后被目的基因替代,没有重组成功的表达载体自然死亡,重组子的特异性也相对特异较高。除了用来鉴定外,构建过程中不需要酶切反应,不需要蓝白菌落筛选,整个构建过程操作相对简单。快捷。本实验结果表明,利用GatewayTM技术构建LMP-1重组腺病毒载体不仅大大简化了基因克隆的步骤,而且显著提高了克隆效率。获得的pAd-LMP-1可进一步用于基因治疗理想的靶细胞的转染,构建骨质疏松症及其骨折的基因治疗的细胞载体。

　　将pAd-LMP-1转染MSC后,LMP-1基因能促进MSC向成骨方向分化,加强其成骨作用。但目前对LMP-1的研究主要是利用重组蛋白或是基因转导的方式来观察其在脊柱融合及骨质缺损中的作用[4-5]。而未使用表达LMP-1 细胞的治疗组却未获得融合[5]。但是,如何将转染pAd-LMP-1的 MSC运用于骨质疏松及其骨折的治疗仍有待于进一步研究,这也是研究进一步工作的目的。

　　值得注意的是,由于LMP-1的强效骨诱导作用,治疗浓度所需的含LMP-1重组病毒远远低于其他基因的重组病毒,Viggeswarapu在利用腺病毒载体将LMP-1基因转导至成骨细胞的实验中,发现MOI = 0.25时成骨作用最为明显,远远低于BMP基因转导所需的高滴度病毒(MOI = 40~500)[5],表明了LMP-1基因强效的成骨作用,同时由于所需的病毒滴度降低,引起机体的免疫反应少,更适合临床前景应用。本试验发现LMP-1在转导MSC时,所用的MOI = 10既表现出明显的成骨作用,MOI低于文献中一般基因病毒转导MSC所需要的MOI[5],但高于Viggeswarapu试验中转导成骨细胞。这一情况可能是由于病毒滴度计算存在有主观差异,也有可能与成骨细胞和骨髓间充质干细胞两种宿主细胞的特性有关。

　　目前国内外在研究骨科疾病基因治疗时多选用MSC作为体外基因转导的靶细胞[9]。MSC是成体干细胞之一,具有多向分化潜能,可分化为成骨细胞。软骨细胞和神经细胞等多种细胞。骨质疏松个体的MSC数量减少,质量也下降,增殖和成骨细胞分化能力减弱,成骨能力也显著降低。MSC主要存在于骨髓基质中,取材相对较容易,分离培养简单。含治疗基因的MSC不仅可以表达有用的骨诱导蛋白,而且自身可以分化成成骨细胞等参与骨重建,它可以通过自分泌机制诱导自身成骨分化,通过旁分泌机制诱导附近的干细胞向成骨分化[10]。本研究的结果表明,MSC转染LMP-1后,不仅增殖。分化能力显著提高,而且成骨活性显著增强。这一结果与文献报道基本相符,因此MSC转染骨诱导因子后不仅可修复骨缺损,也为骨质疏松及其骨折的基因治疗提供了一个新的平台[11]。MSC的这些特性,使其成为骨科基因治疗研究的理想靶细胞,但是近年对MSC在体内恶性转化问题越来越被关注,有实验报道MSC移植导致癌基因突变从而出现纤维肉瘤恶变[12],这一试验结果向包括基因治疗在内的干细胞移植提出挑战,因此干细胞移植在体内的转归以及相关安全性仍需更进一步的研究。

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