慢病毒携带ｓｈＲＮＡ抑制ＣＲ-１基因表达对ＣＮＥ-２细胞特性的影响

　　【摘要】 应用慢病毒介导的RNA干扰(RNAi)技术，有效沉默鼻咽癌细胞CNE-2的CR-1基因表达，研究CR-1对鼻咽癌细胞生物学行为的影响。 【方法】 构建针对CR-1的siRNA慢病毒表达载体[含H1启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]。利用包装细胞293FT生产慢病毒，感染鼻咽癌细胞CNE-2， 流式筛选GFP阳性细胞。应用荧光定量PCR、Western blot检测病毒感染后CNE-2细胞中CR-1基因的mRNA和蛋白表达，获得干扰CR-1基因的细胞群。并用MTT法、平板克隆形成实验及Boyden侵袭小室观察CR-1干扰后对CNE-2细胞生物学行为的影响。 【结果】 PCR 和测序证实，成功构建了CR-1 shRNA的慢病毒载体pLVTHM-shCR-1。荧光定量PCR 和Western blot结果表明，所获得的细胞中CR-1 mRNA及蛋白表达水平较阴性对照组、空白对照组均显著降低(P < 0.05)。CR-1干扰后的细胞生长明显减慢，克隆形成能力减弱，侵袭运动能力下降。 【结论】 通过RNAi技术阻断CR-1的表达，可抑制CNE-2细胞的生长、增殖、迁徙，提示CR-1在鼻咽癌的发生、发展过程中起重要作用。

　　【关键词】 RNA 干扰; 慢病毒; CR-1; 鼻咽癌

　　Inhibition of CR-1 Expression by Lentivirus Mediated shRNA Modulates BiologicalFeatures of Human Nasopharyngeal Carcinoma CNE-2 Cells　1. Department of Pathology， Nanfang Hospital ∥ Department of Pathology， School of Basic Medicine ∥ Key Laboratoryof Transcriptome and Proteome for Human Major Diseases supported by the Ministry of Education and Guangdong Province ∥Guangdong Provincial Key Laboratory of Molecular Tumor Pathology， 2. Institute of Cancer Research，Southern Medical University， Guangzhou 510515， China; 3. Department of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangzhou 510006， China　Abstract： 【Objective】 To study the effect of CR-1 down-regulation by lentivirus-mediated RNA interference (RNAi) silencing technique on the biological features of nasopharyngeal carcinoma cell line CNE-2. 【Methods】 A lentiviral vector for RNAi of CR-1， which contained H1 promoter and green fluorescent protein (GFP) was constructed. Package cells 293FT was used to produce virus stocks. Then CNE-2 cells were infected with the recombinant lentivirus and the cells with CR-1 knock-down were selected by FACS for GFP expression. CR-1 expression in the cells was determined by real-time reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blot. The proliferative and invasive ability of CNE-2 cells were evaluated by MTT methods， the colony-forming unit assay and transwell migration assay， respectively. 【Results】 PCR and DNA sequencing demonstrated that the lentivirus RNAi vector of cripto-1 (pLVTHM-shCR-1) was constructed successfully. Clones of CNE-2 cells infected with the recombinant 人CR-1 (Cripto-1)，是表皮生长因子-CFC (epidermal growth factor-Cripto-1/FRL1/cryptic，Cripto in humans， FRL1 in Xenopus， and cryptic in mice， EGF-CFC)lentivirus were selected and exhibited substantial knock-down of CR-1 mRNA and protein expression compared with the control groups. The proliferation， colony-forming ability and invasive ability of treated CNE-2 cells were inhibited in vitro. 【Conclusion】 The lentivirus-mediated shRNA of CR-1 is efficient in down-regulating CR-1 expression and diminishing the growth， proliferation and invasiveness of CNE-2 cells， suggesting that Cripto-1 might have an oncogene role in the tumorigenesis and progression of NPC.

　　Key words： RNA interference;lentivirus， CR-1; nasopharyngeal carcinoma

　　家族成员，不仅在肿瘤中过表达， 而且通过促进细胞增殖、迁移、侵袭、上皮-间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition， EMT)和血管形成等在肿瘤的发生、发展中发挥癌基因的重要作用[1-3]。我们前期发现相对于永生化鼻咽上皮细胞NP69，鼻咽癌细胞株中CR-1表达水平均上调;不同鼻咽癌细胞株间，其表达在高分化鳞状细胞癌细胞系CNE-1中最低，在低分化但高转移能力的CNE-2及C666-1细胞中最高。鼻咽癌组织中CR-1的阳性表达率无论在mRNA水平还是蛋白水平均明显高于慢性鼻咽炎组(P < 0.05)。提示鼻咽癌与其他癌组织一样存在CR-1高表达， 且CR-1基因表达可能与鼻咽癌的转移及分化程度有关，说明CR-1在鼻咽癌发病过程中可能发挥作用(结果另文报道)。但CR-1在鼻咽癌中确切的作用机制还不清楚，因此本研究中，我们应用RNA干扰(RNA interference， RNAi)技术，选用鼻咽癌细胞株CNE-2作为研究对象，构建CR-1 shRNA的慢病毒表达载体，将其转染至CNE-2细胞内，观察shRNA对CR-1基因有无阻抑作用，并探讨其对CNE-2细胞生物学行为的影响及可能的作用机制，探寻CR-1与鼻咽癌病变发生发展之间的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 材 料

　　1.1.1 细 胞

　　鼻咽癌细胞株CNE-2为南方医科大学肿瘤研究所保存。

　　1.1.2 主要试剂

　　Trizol 试剂购自Invitrogen 公司;DNaseⅠ购自Roche 公司;逆转录及荧光定量试剂盒购自大连宝生物(TaKaRa)工程有限公司。慢病毒包装系统(由肖广辉教授惠赠)包括pLVTHM、psPAX2 和pMD2.G 质粒，其中pLVTHM含有能持续表达小RNA 的元件，同时能表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)，psPAX2 和pMD2.G 含有病毒包装所必须的元件。LipofectmineTM 2000转染试剂盒购自Invitrogen 公司;Taq DNA 聚合酶、dNTP、T4 DNA 连接酶、限制性内切酶、DNA marker、质粒小量提取试剂盒、DNA 凝胶回收试剂盒均购自TaKaRa 公司;质粒中提试剂盒购自Qiagen 公司;CR-1抗体购自美国R&D公司，β-actin抗体及HRP 标记的抗鼠二抗购自武汉博士德公司;增强型化学发光试剂盒购自美国Pierce公司;其它常规试剂均购自北京鼎国生物技术有限公司;大肠杆菌JM109、病毒包装细胞293FT 均由本室保存。

　　1.2 方 法

　　1.2.1 引物及干扰片段的设计与合成 CR-1及内参β-actin

　　基因PCR 引物采用Primer 5. 0软件设计，由上海英骏生物技术有限公司合成。引物序列：CR-1上游引物5′-GATACAGCACAGTAAGGA GC-3′， 下游引物 5′-TAGTTCTGGAGTCCTGGAAG -3′，目的产物286 bp;β-actin上游引物 5′-CACCC AGCACAATGAAGAT-3′，下游引物 5′-CAAATAA AGCCATGCCAAT-3′，目的产物255 bp 。人工合成一对针对CR-1 基因的(CR-1 mRNA nt190， GenBank NM_003212)互补并编码相应短发夹状siRNA 的寡核苷酸链(由上海英骏生物技术有限公司合成)：正义链5′- CGCGTCGCAATGACTCTGAATT AAAGTTCAAGAGACTTTAATTCAGAGTCATTGTTTTTGGCCAT-3′和反义链5′- CGATGGCCAAAAA CAATGACTCTGAATTAAAGTCTCTTGAACTTTAATTCAGAGTCATTGCGA-3′(内含MluⅠ和ClaⅠ酶切位点)[4]。

　　1.2.2 慢病毒表达载体pLVTHM-shCR-1的构建与鉴定

　　针对CR-1基因shRNA的DNA Oligo寡核苷酸序列，经退火形成双链DNA，与经MluⅠ和ClaⅠ双酶切后的pLVTHM 载体在T4 DNA 连接酶作用下于16 ℃连接过夜。连接产物转化JM109大肠杆菌，挑取重组阳性克隆行PCR及测序鉴定(北京华大生物技术有限公司)。PCR鉴定阳性克隆的上游引物： 5′-GTGTCACTAGGCGGGAACAC-3′;下游引物： 5′-TTATTCCCATGCGACGGTATC-3′。阳性重组细菌克隆的PCR产物为273 bp (插入片段为63 bp)，而阴性克隆(双酶切后但没有插入片段的pLVTHM空载体)的PCR产物为210 bp。

　　1.2.3 慢病毒包装

　　用胰蛋白酶消化对数生长期的293FT 细胞，将2 × 106 的细胞数重新接种于10 cm 的培养皿，于37 ℃、体积分数5% CO2 培养24 h，细胞密度达60% ～ 70%时用脂质体LipofectmineTM 2000介导转染以获得重组的慢病毒。转染6 ～ 8 h 后弃去含有转染混和物的培养液，换完全培养基，继续培养48 h，收集转染72 h 后的293FT 细胞上清液，于4 ℃ 4 000 × g 离心10 min，将病毒悬液以0.45 μm滤器过滤分装后置于-80 ℃冰箱中保存。

　　1.2.4 病毒滴度测定 参照文献[5]测定病毒滴度。

　　1.2.5 筛选稳定干扰CR-1表达的细胞克隆

　　2 × 105 CNE-2细胞接种于6孔板，待其融合达30% ～ 50%，用慢病毒感染细胞，以含无关干扰片段的慢病毒为阴性对照，48 h后倒置荧光显微镜下观察绿色荧光。2周后采用流式细胞分选术(fluorescence activated cell sorter，FACS)获得GFP + 细胞。分选的细胞用荧光定量PCR 和Western blot方法鉴定，CR-1稳定表达沉默的细胞亚系命名为CNE-2/GFP+/CR-1-， 阴性对照亚系命名为CNE-2/GFP+/mock。

　　1.2.6 荧光定量PCR方法检测mRNA表达

　　待细胞长至状态良好，铺满瓶壁后，用预冷的PBS洗2遍，加入Trizol 试剂常规提取细胞总RNA，提取的RNA用DNase I去除痕量基因组DNA。按照TaKaRa(PrimeScriptTM RT Reagent Kit)逆转录试剂盒操作程序进行逆转录反应。以β-actin 为内对照，检测干扰前后靶基因表达变化。应用Mx3000P定量PCR仪进行Real-time quantitative RT-PCR实验，检测各模版的Ct值，阴性对照以DNase/RNase-free H2O 为模版。以Folds=2-ΔΔCt表示实验组与对照组目的基因表达的倍比关系，公式如下：ΔΔCt = [Ct(target gene) - Ct(β-actin)]转染细胞-[Ct(target gene)-Ct(β-actin)]对照细胞。干扰率 = 1-2-ΔΔCt × 100%。重复 3 次实验， 计算平均值。

　　1.2.7 Western blot方法检测蛋白表达

　　参照文献[2]检测CR-1的蛋白。

　　1.2.8 MTT检测细胞生长曲线的变化

　　消化下实验组与对照组细胞，按3 × 103 /孔的数量接种于96 孔培养板，设7个时间点(1、2、3、4、5、6、7 d)，每个点设6个复孔，RPMI1640 培养液(含体积分数10%胎牛血清，无抗生素) 37 ℃、体积分数 5% CO2饱和湿度条件下培养。至各时间点，每孔加入0.5 g/L噻唑蓝溶液(MTT)溶液20 μL，继续孵育4 h，吸弃孔内培养液，每孔加入150 μL二甲基亚砜(DMSO)，酶标仪490 nm吸光度读取数值[D(490 nm)]。以时间为横轴，吸光度值为纵轴绘制细胞生长曲线。重复实验3次。

　　1.2.9 平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力

　　将对数生长期的细胞经胰蛋白酶消化成单个细胞悬液并计数，调整细胞数为1 × 105/mL，以200个/孔接种于6孔板，并使细胞分散均匀。实验分为CNE-2/GFP+/CR-1-组、CNE-2/GFP+/mock对照组和CNE-2空白组。每组设3个复孔，置37 ℃、体积分数 5% CO2 的培养箱中，静止培养14 d至6孔板出现肉眼可见的克隆。PBS 洗涤后加纯甲醇1 mL固定15 min，吉姆萨液染色。将培养板置于显微镜低倍数下计数大于50个细胞的克隆数，按公式计算克隆形成率：克隆形成率(%) = 克隆数/接种数 × 100%。

　　1.2.10 Boyden侵袭小室模型测定细胞体外侵袭能力

　　将浓度为0.5 g/L Matrigel人工基质胶20 μL铺于Transwell侵袭小室聚碳酯微孔膜(孔径8 μm)的上表面，37 ℃放置30 min使其凝聚。Transwell上室中分别加入已消化重悬的各组细胞100 μL (1 × 108/L)，下室中分别加入600 μL对应的条件培养上清液。37 ℃、体积分数5% CO2孵育24 h后取出， PBS洗涤，棉签去除滤膜上层细胞，将已经侵入并贴附于微孔膜下层的细胞固定并用吉姆萨液染色，显微镜下直接观察穿过膜的细胞数。随机计数5个视野，计数每个视野内穿过8 μm微孔的细胞数。以侵袭细胞的相对数目来表示肿瘤细胞的侵袭能力。重复实验3次。

　　1.3　统计学处理

　　数据以x ± s表示。采用SPSS 15.0 统计软件进行单因素方差分析，采用SNK法进行两组间比较。

　　2　结 果

　　2.1 阳性克隆的PCR鉴定

　　PCR鉴定阳性克隆，鉴定结果与预期相符(图1)。测序结果表明合成的CR-1shRNA寡核苷酸链序列插入正确(109 ～ 171)，此时命名慢病毒重组载体为pLVTHM-shCR-1。

　　2.2 慢病毒载体的包装及滴度测定

　　将包装好的慢病毒颗粒梯度稀释后转染293FT细胞，倒置荧光显微镜下可见GFP的表达，观察各孔中表达GFP的293FT阳性细胞数，病毒滴度为表达GFP的细胞数乘以相应稀释倍数，测定滴度为4.2 × 105 TU/mL。

　　2.3 慢病毒感染CNE-2细胞

　　感染后48 h倒置荧光显微镜下可见GFP的表达，2周后FACS分选GFP+ 细胞，分选后细胞纯度达到98%以上(图2)。

　　2.4 荧光定量PCR检测

　　荧光定量PCR的结果显示，熔解曲线分析未见杂峰，说明扩增产物单一特异，没有非特异性扩增。通过公式计算，干扰细胞的CR-1 mRNA表达量仅为对照的13.76%，即干扰效率为86.24%。将干扰细胞命名为CNE-2/GFP+/CR-1-，将阴性对照病毒感染的细胞命名CNE-2/GFP+/mock。

　　2.5 Western blot 检测

　　CNE-2/GFP+/CR-1- 细胞CR-1蛋白的表达明显低于两对照组(P < 0.01)，而两对照组之间CR-1蛋白的表达无统计学差异(P > 0.05)。进一步表明合成的针对CR-1基因的shRNA 片段，能特异性下调CNE-2细胞的CR-1蛋白表达(图3)。

　　2.5 MTT细胞生长曲线的变化

　　经MTT检测，与CNE-2 和CNE-2/GFP+/mock细胞相比，CNE-2/GFP+/CR-1- 细胞的增殖速度明显减慢，三组差异有统计学意义(F = 19.932，P = 0.00)，CR-1表达抑制后细胞生长受抑(图4)。

　　2.6 平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力

　　3组细胞培养2周后均有克隆形成，CNE-2组克隆形成率为(67.0 ± 2.8)%;CNE-2/GFP+/mock组克隆形成率分别为(72.3 ± 4.9)%;CNE-2/GFP+/CR-1- 组克隆形成率为(51.7 ± 3.1)%。CNE-2/GFP+/CR-1- 组克隆形成率较对照组明显减少，差异有显著意义(F = 25.475，P = 0.001)， CNE-2和CNE-2/GFP+/mock组之间无明显差异。表明CR-1表达下调后降低了CNE-2细胞克隆形成能力， 细胞增殖活性受抑。

　　2.7　Boyden侵袭小室模型测定细胞体外侵袭能力

　　3组细胞在Boyden侵袭小室中24 h穿膜细胞数比较，CNE-2组、CNE-2/GFP+/mock组与CNE-2/GFP+/CR-1- 组穿膜细胞数分别为101.4 ± 4.5、99.6 ± 4.0、41.6 ± 5.9，与另两组比较， CNE-2/GFP+/CR-1- 组穿膜细胞数明显减少(F = 240.723，P < 0.01;图5)，而CNE-2 和CNE-2/GFP+/mock组比较无统计学差异，表明抑制CR-1表达后可降低CNE-2细胞的体外侵袭能力。

　　3 讨 论

　　目前认为遗传因素、爱波斯坦-巴尔病毒(Epstein Barr virus，EBV)感染、某些环境化学促癌物和/或致癌物因素与鼻咽癌的发生发展有关[6]。由于鼻咽癌是一种低分化、高转移性恶性肿瘤，侵袭和转移仍是导致鼻咽癌患者死亡的主要原因，且治疗后5年生存率始终在60%以下，因此探索鼻咽癌病因及其癌变的分子机制具有重要意义。我们前期的工作证实鼻咽癌与其他已报道癌组织一样存在CR-1高表达，但其在鼻咽癌中确切的作用及机制还不清楚。本研究中，我们首先成功构建了含有GFP报告基因、特异性干扰CR-1基因的慢病毒载体。重组病毒颗粒感染CNE-2后，利用流式分选GFP+ 细胞筛选出稳定干扰CR-1表达的鼻咽癌细胞亚系，经mRNA 和蛋白水平验证后，命名为CNE-2/GFP+/CR-1-。这为进一步了解CR-1在鼻咽癌发生发展中可能的作用，提供了有效工具。

　　多项体内及体外实验均显示CR-1主要是通过促进细胞增殖、生存、迁徙及侵袭，在肿瘤发生发展中发挥重要的癌基因作用。过表达CR-1的人MCF-7 乳腺癌细胞生长速率增快及软琼脂克隆形成能力增加[7];在鼠乳腺组织中过表达人CR-1基因导致乳腺发生增生和腺癌的改变[2]。本研究中，相对于CNE-2 和CNE-2/GFP+/mock，CNE-2/GFP+/CR-1- 的生物学行为发生了明显的变化。MTT实验及平板克隆形成实验结果显示，在抑制内源性CR-1表达后，细胞生长减慢;克隆形成能力下降，差异具有统计学意义(P < 0.05)。提示CR-1可促进鼻咽癌细胞的生长和增殖。

　　作为公认的癌基因，CR-1不仅在肿瘤中表达， 而且与肿瘤转移潜能密切相关[8]。Ciardiello 等[9]报道在原发结肠癌及肝脏转移中Cripto-1 mRNA 的表达率分别是68.2% (30/44)和 61.8% (21/34)， 而在正常组织则仅为1.5%(1/65)。此外，相对于原发瘤，在淋巴结转移中CR-1的表达水平亦明显增加。Strizzi等[10]报道CR-1在促进和增加EMT相关标志物及信号分子的表达上起重要作用。有研究发现Wnt/b-catenin/Lef-1信号通路可能和CR-1信号通路存在相互作用，从而调节细胞黏附和迁移[11]。本研究中，体外Boyden侵袭小室24 h穿膜细胞数比较，相对于CNE-2组和CNE-2/GFP+/mock组，在CR-1表达受到抑制后，CNE-2/GFP+/CR-1- 细胞的侵袭能力显著下降，而CNE-2 和CNE-2/GFP+/mock组比较无统计学差异，表明CR-1能促进肿瘤细胞的运动、迁徙、侵袭能力。

　　尽管CR-1与肿瘤发生发展密切相关，但其中的确切机制还不清楚。在胚胎发生时，CR-1主要是作为转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)家族成员Nodal的共受体，激活Nodal/ALK4/ALK7/Smad-2信号通路而发挥作用。而作为癌基因，CR-1还可通过Nodal非依赖的信号通路，促进细胞生存、增殖、运动、侵袭及肿瘤血管发生。已经证实的Nodal非依赖的信号通路主要有两条：ras/raf/mitogen-activated protein kinase (MAPK)通路和phopshatidylinositol 3′kinase (PI3K)/Akt通路[12]。通过和硫酸类肝素蛋白多糖：磷脂酰肌醇聚糖-1(glypican-1)的结合，CR-1激活酪氨酸激酶、c-Src进而触发MAPK和Akt这两条胞内信号通路。此外，还有文献报道CR-1的表达与整合素、转录因子Snail的活性之间亦存在正向关联[11，13]。

　　上述实验结果表明，CR-1参与了鼻咽癌的发生及演进，抑制其表达可抑制CNE-2细胞的生长、克隆形成及侵袭能力。这为深入理解鼻咽癌发病的分子机制、寻找分子治疗靶标提供了实验依据和新线索。对于CR-1在鼻咽癌中的发挥作用所涉及的信号通路我们将利用有效沉默其表达的CNE-2/GFP+/CR-1- 细胞进一步研究。

　　【参考文献】

　　[1]Bianco C， Normanno N， Salomon DS， et al. Role of the Cripto (Egf-Cfc) family in embryogenesis and cancer [J]. Growth Factors， 2004， 22(3)：133-139.

　　[2]Sun Y， Strizzi L， Raafat A， et al. Overexpression of human Cripto-1 in transgenic mice delays mammary gland development and differentiation and induces mammary tumorigenesis [J]. Am J Pathol， 2005， 167(2)： 585-597.

　　[3]Bianco C， Strizzi L， Ebert A， et al. Role of human Cripto-1 in tumor angiogenesis [J]. J Natl Cancer Inst， 2005， 97(2)： 132-141.

　　[4]Gray PC， Shani G， Aung K， et al. Cripto binds transforming growth factor beta (Tgf-Beta) and inhibits tgf-beta signaling [J]. Mol Cell Biol， 2006， 26(24)：9268-9278.

　　[5]Tiscornia G， Singer O， Verma IM. Production and purification of lentiviral vectors [J]. Nat Protoc， 2006， 1(1)： 241-245.

　　[6]宗永生，吴秋良，林素暇，等. Eb 病毒相关性疾病理学研究的进展 [J]. 中山大学学报：医学科学版， 2005， 26(5)： 481-487.

　　[7]Normanno N， De Luca A， Bianco C， et al. Cripto-1 overexpression leads to enhanced invasiveness and resistance to anoikis in human mcf-7 breast cancer cells [J]. J Cell Physiol， 2004， 198(1)： 31-39.

　　[8]Strizzi L， Bianco C， Normanno N， et al. Cripto-1： A multifunctional modulator during embryogenesis and oncogenesis [J]. Oncogene， 2005， 24(37)：5731-5741.

　　[9]Ciardiello F， Kim N， Saeki T， et al. Differential expression of epidermal growth factor-related proteins in human colorectal tumors[J]. Proc Natl Acad Sci U S A， 1991， 88(17)： 7792-7796.

　　[10]Ertoy D， Ayhan A， Sarac E， et al. Clinicopathological implication f cripto expression in early stage invasive cervical carcinomas [J]. Eur J Cancer， 2000， 36(8)：1002-1007.

　　[11]Strizzi L， Bianco C， Normanno N， et al. Epithelial mesenchymal transition is a characteristic of hyperplasias and tumors in mammary gland from Mmtv-Cripto-1 transgenic mice[J]. J Cell Physiol， 2004， 201(2)： 266-276.

　　[12]Ebert AD， Wechselberger C， Frank S， et al. Cripto-1 induces phosphatidylinositol 3′-kinase-dependent phosphorylation of akt and glycogen synthase kinase 3beta in human cervical carcinoma cells[J]. Cancer Res， 1999， 59(18)： 4502-4505.

　　[13]Strizzi L， Postovit LM， Margaryan NV， et al. Emerging roles of nodaland cripto-1： from embryogenesis to breast cancer progression[J]. Breast Dis， 2008， 29(8)： 91-103.