脊髓和海马锌含量在吗啡耐受和ＭＫ-８０１抗吗啡耐受中的作用

　　【摘要】 探讨吗啡耐受大鼠脊髓和海马锌(Zn2+)含量的变化及其在MK-801抗吗啡耐受中的作用。【方法】 采用SD成年雄性大鼠，建立慢性吗啡耐受大鼠模型，用热水甩尾法测定甩尾潜伏期观察痛反应变化。将实验动物随机地分为如下4组：生理盐水-生理盐水(NS-NS)组，生理盐水-吗啡(NS-Mor)组，MK-801-生理盐水(MK-NS)组，MK-801-吗啡(MK-Mor)组。用原子吸收光谱法测定脊髓和海马Zn2+ 含量在吗啡耐受中的变化。 【结果】 吗啡耐受大鼠的脊髓和海马Zn2+ 含量明显降低(P < 0.05);MK-801(0.1 mg/kg)本身对基础痛阈及Zn2+ 含量无明显影响，但与吗啡合用则具有显著的抗吗啡耐受作用，并阻断慢性吗啡引起的脊髓和海马Zn2+ 含量的降低(P < 0.001)。【结论】 吗啡耐受过程中，大鼠脊髓和海马组织中的Zn2+ 含量明显减少，翻转吗啡耐受时脊髓与海马Zn2+ 含量的减少，可能是MK-801抗吗啡耐受的机制之一。

　　【关键词】 吗啡; MK-801; 锌; 脊髓; 海马

　　Roles of Zinc Concentration of Spinal Cord and Hippocampus in Morphine Toleranceand Inhibition of Morphine Tolerance by MK-801　　GUO Rui-xian， ZHANG Mei， CUI Yu， LIU Wei， YANG Chun-tao， CHEN Pei-xi， FENG Jian-qiang　1. Department of Physiology， Zhongshan Medical College， Sun Yat-sen University， Guangzhou 510080， China;2. Department of Pharmacology， Guangzhou Medical College， Guangzhou 510082， China　　Abstract： 【Objective】 To investigate the changes of zinc levels of spinal cord and hippocampus in morphine tolerance rats and its role in the blockage of morphine tolerance by MK-801. 【Methods】 In the adult Sprague-dawley rats， chronic morphine tolerance rat model was established. Animals were randomly divided into 4 groups： saline-saline group， saline-morphine group， MK-801-saline group and MK-801-morphine group. The zinc concentrations in the spinal cord and hippocampus were examined by atomic absorption spectrometry. 【Results】 Zinc levels were decreased in both the spinal cord and hippocampus in chronic morphine tolerance rats (P < 0.05). MK-801(0.1 mg/kg) alone did not affect the basal pain threshold and zinc level. however， when co-administrated with morphine， MK-801(0.1 mg/kg) significantly antagonized morphine tolerance along with blocking chronic morphine-induced reduction of zinc levels in rat spinal cord and hippocampus (P < 0.001). 【Conclusion】 Zinc levels in rat spinal cord and hippocampus were obviously attenuated in morphine tolerance rat. One of the mechanisms underlying the blockage of morphine tolerance by MK-801 is to reverse the decrease in zinc levels induced by morphine tolerance.

　　Key words： morphine; MK-801; zinc; spinal cord; hippocampus

　　锌(Zn2+)是一种体内必需的微量元素。与其他器官相比，中枢神经系统含有大量的Zn2+，其中约有10%的Zn2+ 以自由态存在于一小部分神经元轴突终末的突触小泡内[1]。游离的Zn2+ 并非均匀地分布于中枢神经系统，在脊髓背角[2]和海马[3]呈优势分布。进一步的研究发现，在中枢神经系统，游离的Zn2+与谷氨酸、甘氨酸和?酌-氨基丁酸(GABA)共存[4-5]。在突触活动中，游离的Zn2+ 可能与这些共存的神经递质共同释放到突触间隙内，作为神经递质调节突触后受体，如N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)、?琢-氨基羟甲基恶唑丙酸(AMPA)、GABA以及甘氨酸受体)的功能。有研究表明，游离Zn2+ 参与脊髓伤害性信息传递。鞘内注射Zn2+具有镇痛作用，而Zn2+的螯合剂则导致痛觉过敏[6]。Zn2+ 能够减缓神经损伤或外周炎症所致的痛觉过敏[7-8]。在L5结扎致病理性疼痛模型，脊髓背角游离的Zn2+ 含量降低[9]。饮食中缺Zn2+，吗啡的镇痛作用减弱[10]。鞘内注射Zn2+ 拮抗急性吗啡耐受的形成，减少戒断症状的出现，而乙二胺四乙酸(EDTA)则促进吗啡戒断反应的出现[11]。可见，在吗啡耐受/依赖和病理性疼痛的形成机制中，游离Zn2+ 发挥着一定的作用。已有研究表明，兴奋性氨基酸(excitatory amino acid systems， EAA)和NMDA受体参与吗啡耐受形成。但是，关于吗啡耐受时，海马和脊髓游离的Zn2+ 含量是否发生变化以及NMDA受体在其中的作用，尚未见报道。因此，本研究旨在观察在吗啡耐受中，大鼠脊髓和海马Zn2+ 含量的变化;MK-801(NMDA受体的非竞争性拮抗剂)拮抗吗啡耐受的同时能否影响脊髓和海马组织Zn2+ 含量的变化。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂

　　盐酸吗啡购自青海制药厂;MK-801购自英国Calbiochem-Novabiochem公司。

　　1.2 慢性吗啡耐受大鼠模型的建立与动物分组

　　实验采用成年健康雄性SD(Sprague-Danley)大鼠，体质量200 ～ 250 g，尾部完好，由中山大学北校区实验动物中心提供。动物随机地分为如下4组：①生理盐水-生理盐水(NS-NS)组，②生理盐水-吗啡(NS-Mor)组，③MK801-生理盐水(MK-NS)组，④MK801-吗啡(MK-Mor)组。参照文献[12]，大鼠皮下注射吗啡，10 mg/kg 每日2次(分别在8：00 AM和5：00 PM注射)，连续9 d，建立慢性吗啡耐受模型，对照组注射等体积的生理盐水。MK-801剂量为0.1 mg/kg，腹腔注射。各组均在第1种药物给药30 min后给予第2种药物。

　　1.3 测痛方法

　　吗啡的镇痛效果采用热水甩尾法(hot-water tail-flick)测定甩尾潜伏期(tail flick latency， TFL)的变化来评价。将适应饲养环境1周后大鼠放入大鼠固定器内，大鼠可以在容器中自由前后活动，姿势自然舒适，尾部暴露于外。轻轻拖住装有大鼠的容器，把大鼠尾部末端1/3迅速放入恒温的热水中(50 ℃ ± 0.2 ℃)，记录从大鼠尾部入热水到开始甩尾的时间，即TFL(单位为s)。动物尾部在热水中停留最长时间为15 s，以免对尾部造成损伤。按照上述方法连续测定3次，两次间隔5 min。取3次潜伏期的平均值作为基础甩尾潜伏期(basal TFL， BL)。基础阈值在3 ～ 5 s之间。阈值超过5 s的动物从实验中排除。在给予吗啡注射后1 h分别测定实验甩尾潜伏期(test TFL，TL)。计算最大效应百分率(percent of maximal potential effect， rMPE = (tTL - tBL)/(tcut-off - tBL) × 100%)，用以表示药物对痛反应的影响。

　　1.4 锌含量的测定

　　采用原子吸收光谱法。在实验的第9天下午给药后1 h，经腹腔注射戊巴比妥钠(45 mg/kg)麻醉大鼠，在冰上迅速分离脊髓和海马，称质量，置于干净的试管中，加入0.5 mL浓硝酸，沸水浴孵育1 h，直至溶液清澈透明，加蒸馏水至1 mL，应用空气-乙炔火焰法，在213.9 nm波长测定光密度D以计算Zn2+含量。同时设定空白对照(无任何组织)。Zn2+含量采用下述公式计算：(D样品- D空白) × V定容 / m组织。

　　1.5 统计分析

　　使用软件SPSS 10.0进行统计处理。数据均以均数 ± 标准差(x ± s)表示。多组间计量资料比较使用单因素方差分析(one-way ANOVA方法)，组间的多重比较使用最小有意义差异t-检验(LSD法)，检验水准α = 0.05。

　　2 结 果

　　2.1 慢性吗啡耐受大鼠模型的建立

　　热水甩尾法测痛结果表明，在实验过程中，对照组(NS-NS组)的痛反应阈值与基础阈值差异无统计学意义(P > 0.05)，表明生理盐水对痛反应无影响(图1)。与NS-NS组相应的的rMPE相比，1 d和3 d吗啡组(NS-Mor组)的镇痛效果显著(rMPE分别为100 ± 0和97.55 ± 0.66，P < 0.001);5 d吗啡组虽然仍有明显的镇痛作用(rMPE 59.50 ± 4.54 vs -0.75 ± 3.19，P < 0.001)，但与1 d、3 d吗啡组比较，吗啡的镇痛作用明显下降(P < 0.001);注射吗啡7 d和9 d，其镇痛作用进一步减弱，rMPE分别为35.35 ± 3.30和11.31 ± 1.58(图1)。吗啡镇痛效果减弱的变化趋势表明，至注射第9天时，大鼠对吗啡的镇痛作用已经形成明显的耐受。

　　2.2 MK-801拮抗吗啡耐受

　　图1结果显示，单纯连续9 d注射MK-801(0.1 mg/kg， 每日2次，MK-NS组)不能产生镇痛作用，与NS-NS组比较差异无统计学意义(P > 0.05，图1)。然而，在联合应用吗啡与MK-801(MK-Mor组)，虽然吗啡的镇痛效果也逐渐降低，但是与NS-Mor组相比，吗啡的镇痛效果明显强于NS-Mor组， rMPE分别为：给药第5天，MK-Mor组 91.62 ± 3.09 vs NS-Mor组 59.5 ± 4.54;第7天，MK-Mor组 77.0 ± 2.40 vs NS-Mor组35.34 ± 3.30;第9天，MK-Mor组 67.36 ± 2.05 vs NS-Mor组 11.31 ± 1.58，(P均 < 0.001，图1)。以上结果提示，MK-801(0.1 mg/kg)与吗啡合用具有抑制吗啡耐受的作用。

　　2.3 慢性吗啡耐受引起大鼠的脊髓Zn2+含量降低

　　原子吸收光谱法测定Zn2+含量的结果表明，与NS-NS组相比，慢性给予吗啡9 d，即吗啡耐受形成，脊髓的Zn2+含量明显降低(P < 0.05，表1)。

　　2.4 MK-801对吗啡耐受时脊髓Zn2+含量降低的影响

　　MK-801与吗啡合用时对吗啡耐受时脊髓Zn2+含量的变化。表1的结果显示，在给药的第9天，与NS-Mor组相比，MK-Mor组大鼠脊髓的Zn2+含量显著增加(P < 0.001);与NS-NS组相比，MK-Mor组脊髓的Zn2+含量亦显著增加(P < 0.05)。上述结果提示，MK-801与吗啡合用拮抗吗啡耐受的同时，能逆转吗啡耐受引起的脊髓Zn2+含量的降低。然而，单纯慢性给予MK-801(0.1 mg/kg)对脊髓Zn2+含量无显著影响，差异无统计学意义(P > 0.05)。

　　2.5 慢性吗啡耐受引起大鼠的海马Zn2+含量降低

　　原子吸收光谱法测定Zn2+含量的结果表明，与NS-NS组相比，慢性给予吗啡9 d，海马的Zn2+含量(NS-Mor组 10.65 ± 0.54 vs NS-NS组 11.45 ± 0.35)明显降低(P < 0.05，图2)。

　　2.6 MK-801对吗啡耐受时海马Zn2+含量降低的影响

　　图2的结果显示，在给药的第9天，与NS-Mor组相比，MK-Mor组大鼠海马的Zn2+含量(12.71 ± 0.99 vs NS-Mor组10.65 ± 0.54)显著增加(P<0.001);与NS-NS组相比，MK-Mor组海马的Zn2+含量(12.71 ± 0.99 vs NS-NS组11.45 ± 0.35)亦显著增加(P < 0.05，图2)。上述结果提示，MK-801与吗啡合用拮抗吗啡耐受的同时，能逆转吗啡耐受引起的海马Zn2+含量的降低。然而，单纯慢性给予MK-801(0.1 mg/kg)对海马Zn2+含量(11.54 ± 0.31 vs NS-NS组11.45 ± 0.35)无显著影响，差异无统计学意义(P > 0.05，图2)。

　　3 讨 论

　　脊髓和海马是参与吗啡耐受的重要中枢结构，EAA和NMDA受体信号系统也参与吗啡耐受机制，而且Zn2+与EAA和NMDA受体在结构和功能上存在密切的联系。在脊髓和海马，Zn2+ 均与谷氨酸共存于谷氨酸能突触末梢，在突触活动中，共同释放到突触间隙。一方面，Zn2+ 可以调节谷氨酸的释放;另一方面，在NMDA受体上存在高亲和性和低亲和性的Zn2+ 结合位点，Zn2+ 直接参与NMDA受体介导的兴奋性突触后电流的调节。电生理的研究表明，海马苔藓纤维末梢释放的Zn2+ 通过高亲和力非电压依赖性和低亲和力电压依赖性机制抑制NMDA受体介导的反应[13]。Zn2+ 可以抑制甘氨酸与其位点的结合从而抑制NMDA受体的功能[14]。另有报道Zn2+ 可以抑制NOS[15]。已经证实，EAA-NMDA-NOS系统在吗啡耐受机制中起着重要的作用。因此，本文推测Zn2+ 可能参与吗啡耐受的形成。本实验的结果证实，吗啡耐受过程中，大鼠的脊髓和海马组织中的游离Zn2+ 浓度明显降低，这与本文的推测相吻合。有研究指出，吗啡依赖小鼠的脑组织Zn2+含量降低[16];海洛因吸食者脑脊液中Zn2+含量低于正常人。结合本文的实验结果，可以推测吗啡依赖与吗啡耐受时，Zn2+ 可能起着重要的介导作用。其机制可能是：脊髓和海马组织中游离的Zn2+含量减少，从而对NMDA受体的抑制作用减弱，使NMDA受体介导的反应增强，并与吗啡耐受引起的NMDA受体表达的上调[17]共同参与吗啡耐受机制。另外，在脊髓，Zn2+主要存在于GABA能神经末梢的囊泡内，Zn2+ 减少将导致GABA释放减少，对伤害性信息传递的抑制性作用减弱，兴奋性信息传入增加。Zn2+也存在于脊髓的甘氨酸能神经末梢的囊泡内，调节甘氨酸的释放和甘氨酸介导的IPSP[18]。吗啡耐受时，脊髓Zn2+ 浓度的降低也可能影响其对甘氨酸的释放及对甘氨酸介导的IPSC的抑制作用，从而参与吗啡耐受的形成。鉴于Zn2+与在吗啡耐受中起着重要作用的NMDA受体在结构和功能上的联系，本研究进一步观察了MK-801拮抗吗啡耐受时对Zn2+含量减少的影响。结果表明，MK-801与吗啡合用，不仅能够拮抗吗啡耐受的形成，而且可以翻转吗啡耐受导致的脊髓和海马Zn2+含量的减少。提示MK-801除了直接作用于NMDA受体外，也可以通过上调Zn2+ 的浓度，抑制谷氨酸的释放，二者协同抑制NMDA受体的活动，从而发挥其抗吗啡耐受形成的作用。

　　综上所述，本实验首次证实慢性给予吗啡可使大鼠脊髓和海马Zn2+的浓度降低;MK-801与吗啡合用，在拮抗吗啡耐受形成的同时，能够逆转吗啡耐受所导致的脊髓和海马Zn2+ 浓度的降低;提示Zn2+在吗啡耐受形成过程中发挥重要的作用，并且为吗啡耐受的防治开拓新思路。

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