卵巢癌血管生成拟态形态学观察和基质金属蛋白酶表达

　　【摘要】 目的：在卵巢癌腹腔移植瘤模型中进行卵巢癌血管生成拟态的形态学观察并检测基质金属蛋白酶2(MMP2)的表达情况。方法：卵巢癌细胞SKOV3接种裸鼠腹腔，建立卵巢癌腹腔移植瘤模型，在同一张切片上以抗鼠CD34标记鼠血管内皮细胞，PAS染色行基底膜样结构标记。并应用免疫组化和RT-PCR方法比较MMP2在卵巢癌腹腔移植瘤中央和边缘区域组织的表达差异。结果：卵巢癌腹腔移植瘤中央区域可见卵巢癌细胞围成管状结构，中间可见红细胞，未见CD34阳性细胞出现, PAS阳性物质呈颗粒状弥散分布在卵巢癌细胞浆内，有的贴附在管腔内侧。免疫组化提示MMP2蛋白阳性表达率在肿瘤中央区域组织比肿瘤边缘区域明显增高，RT-PCR分析显示肿瘤组织中央区域MMP2表达与边缘区域相比有显著性差异。结论：卵巢癌细胞分泌PAS阳性物质，可能参与构建肿瘤的血管基质重塑。卵巢癌中央区域可见血管生成拟态，肿瘤中央区域MMP2表达高于肿瘤边缘区域，MMP2表达是否与卵巢癌血管生成拟态形成有关，仍需今后进一步研究。

　　【关键词】 卵巢癌;血管生成拟态;基质金属蛋白酶2

　　Morphologic observation of vasculogenic mimicry and expression of MMP2 in ovarian carcinoma

　　SU Min1, HUANG Hua2, SUN Feng3, et al (1Department of Gynecology and Obstetrics, 2 Department of Pathology, 3Laboratory of Hematology, Affiliated Hospital of Nantong University, Nantong 226001)

　　[Abstract] Objective: To determine the formation of vasculogenic mimicry and the expression of matrix metalloproteinase 2(MMP2) in ovarian carcinoma in vivo, after the transplantable tumor model of nude mice was established. Methods: Ovarian carcinoma cells SKOV3 were implanted into peritoneal cavity of nude mice. When the transplantable tumor developed, sections of paraffin-embedded and formaldehyde-fixed tissues were stained with PAS and CD34 to study the morphology and distribution of vasculogenic mimicry. Expression of MMP2 was detected by immunohistochemical staining and RT-PCR in the center and the marginal part of the tumor. Results: Vasculogenic mimicry, when PAS was positive but CD34 was negative, appeared in the center of tumor tissues. Ovarian carcinomatous cells formed patterned network with red blood cells in it. PAS positive substance was distributed over the cytoplasm of ovarian carcinomatous cells and sometimes adhere to the wall of the network. The levels of MMP2 mRNA and protein were higher in the center of the tumor tissue than those in the marginal area. Conclusion: Ovarian carcinomatous cells secrete PAS positive substances, which is related to remodeling vascular matrix in tumor. Vasculogenic mimicry appears in the center of tumor tissues. Expression level of MMP2 in the center of tumor tissues is higher than that in the marginal area. It must be further studied whether MMP2 takes part in formation of vasculogenic mimicry.

　　[Key words] Vasculogenic mimicry; Ovarian carcinoma;Matrix metalloproteinase 2

　　在葡萄膜黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、软组织肿瘤以及卵巢癌等高度恶性肿瘤中存在血管生成拟态[1-3]。这些恶性肿瘤细胞在没有血管内皮细胞的参与下直接形成特有的微循环管道，有学者报道通过CD31和PAS双重染色来观察恶性黑色素瘤血管生成拟态的形态学特征[4]。本实验建立裸鼠卵巢癌腹腔移植瘤模型，采用抗鼠CD34标记鼠血管内皮细胞，PAS染色行基底膜样结构标记来进行体内卵巢癌血管生成拟态的形态学观察和定位，并应用免疫组化和RT-PCR法比较基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP2)在卵巢癌腹腔移植瘤中央和边缘区域组织的表达差异。

　　1 材料与方法

　　1.1 细胞株及实验动物 人卵巢浆液性囊腺癌细胞株SKOV3由复旦大学妇产科医院丰有吉教授惠赠。6周龄BALB/C雌性裸鼠12只由南通大学动物实验中心提供，动物实验在SPF级实验动物室进行。

　　1.2 实验药物及试剂 主要试剂：RPMI1640细胞培养基、胎牛血清购自Gibco公司，鼠抗人CD34单克隆抗体一抗，兔抗人单克隆抗体MMP2购自博士德公司，山羊抗兔生物素标记二抗购自DAKO公司，ABC免疫组化试剂盒购自华美生物工程有限公司。

　　1.3 裸鼠腹腔移植瘤模型的建立 SKOV3细胞悬液注射于12只裸鼠腹腔(每只3 ×106个细胞)，待裸鼠腹水显著、接近死亡时处死裸鼠，取出腹腔移植瘤组织及肿瘤周边组织。10%甲醛固定，石蜡包埋，5 μm连续切片。

　　1.4 CD34/PAS双重染色 所收集的组织标本制片后二甲苯脱蜡，酒精梯度脱水，3%H2O2去除内源性过氧化物酶活性，组织抗原微波修复，10%羊血清封闭1∶100鼠抗人CD34单克隆抗体一抗，室温孵育2小时生物素标记的羊抗鼠抗体，HRP标记的链霉卵白素，DAB反应,显微镜下观察到内皮细胞着色后, 终止显色反应，0.5%高碘酸溶液还原8~10 min，Schiff液染色10 min，蒸馏水返色, 苏木精对比染色，显微镜下观察。

　　1.5 免疫组化 石蜡标本二甲苯脱蜡，酒精梯度水化，3%H2O2去除内源性过氧化物酶活性，组织抗原微波修复，10%羊血清封闭1∶100鼠抗人MMP-2单克隆抗体一抗,室温孵育2 h，生物素标记的羊抗鼠抗体，室温30 min，HRP标记的链霉卵白素，DAB反应显色，苏木素复染，显微镜下观察。结果判定：以鼠的IgG代替一抗作为阴性对照。细胞核和(或)细胞浆呈淡黄色、黄色、棕黄色颗粒为阳性。两位病理科医师进行盲法读片，按Formwitz半定量积分法，随机选择5个高倍镜视野，每个视野计数阳性细胞数所占百分比：≤5%计0分;~25%计1分;~50%计2分;~75%计3分;>75%计4分。细胞染色强度：无色计0分;淡黄色计1分;黄色计2分;棕黄色计3分。两者相乘即是最后结果：0分为阴性(-);1～4分为弱阳性(+);5～8分为阳性(++);9～12分为强阳性(+++)。

　　2 结 果

　　2.1 裸鼠腹腔移植瘤镜下观察 处死荷瘤鼠, 腹腔内见1~2 ml血性腹水，肿瘤呈实性，弥漫性生长, 直径大小0.5~1.5 cm不等, 浸润肠肝脾等腹腔脏器。

　　2.2 CD34/PAS双重染色 取卵巢癌腹腔移植瘤中央区域组织行CD34/PAS双重染色，结果显示部分肿瘤细胞灶性表达PAS阳性物质，部分PAS阳性物质将肿瘤细胞同管腔分隔，肿瘤细胞构成的管腔结构中没有CD34阳性的内皮细胞衬覆，管腔结构中可见红细胞。见图1。

　　2.3 MMP2在卵巢癌腹腔移植瘤中央区域和边缘区域组织的表达 MMP2阳性产物为棕黄色颗粒，主要分布于细胞浆中。裸鼠卵巢浆液性腺癌腹腔移植瘤中有MMP2表达。MMP2蛋白在裸鼠卵巢癌腹腔移殖瘤中央区域表达-~++ 3例，+++ 9例(75.0%);边缘区域表达-~++ 10例，+++ 2例(16.7%)，MMP2蛋白阳性表达率在肿瘤中央区域组织比肿瘤边缘区域明显增高(P<0.05 )，图2、3。

　　2.4 MMP2-mRNA在卵巢癌腹腔移植瘤中央和边缘区域组织的表达 RT-PCR分析显示卵巢癌腹腔移植瘤肿瘤细胞表达MMP2, 肿瘤组织中央区域MMP2表达相对值(0.764±0.026)与边缘区域(0.483±0.039)相比，差异有统计学意义(P<0.05)，见图4。

　　3 讨 论

　　少数高度恶性肿瘤在没有血管内皮细胞的参与下，肿瘤细胞表型出现转化，通过自身变形直接形成特有的微循环管道，被称为血管生成拟态(vasculogenic mimicry,VM)。这种拟态血管的管壁结构与血管生成不一样，无血管内皮细胞衬覆。VM是近年来发现的存在于部分高度恶性肿瘤如乳腺癌、前列腺癌、肝癌、恶性黑色素瘤、卵巢癌等内的一种新的肿瘤血液供应方式。高度恶性的肿瘤细胞在快速生长期间，通过肿瘤血管生成所形成的内皮依赖性血管无法满足其血液供应的需要时，肿瘤细胞可以通过血管生成拟态这种微循环管道来获取营养，使得肿瘤具有高度侵袭性。

　　美国Iowa大学的Maniotis等研究高侵袭性葡萄膜黑色素瘤时发现：直径>1 cm的肿块很少坏死，但是普通病理切片上难以见到由血管内皮细胞构成的新生血管;PAS染色可见多种阳性管道结构，无内皮细胞衬覆，肿瘤细胞模仿机体血管形成脉管，和原有静脉连接，有的管道可见红细胞。孙保存[4]等通过CD31和PAS双重染色来观察黑色素瘤内血管生成拟态的形态学特征，发现CD31染色阴性的肿瘤细胞可围成管腔，内衬樱桃红色的PAS阳性物质,管腔内有成堆的红细胞;也有些血管生成拟态中肿瘤细胞围成的不规则管腔内无PAS阳性物质衬复,管腔内存在红细胞，但部分黑色素瘤细胞能够表达PAS阳性物质。

　　本实验中也发现类似现象, 我们在同一张切片上同时进行免疫组织化学染色和组织化学双重染色，采用内皮细胞标记物抗鼠CD34标记鼠血管内皮细胞，采用PAS染色行基底膜样结构标记,结果显示在卵巢癌腹腔移植瘤中央区域，卵巢癌细胞围成管状结构，中间可见红细胞，这种血管生成拟态结构中没有CD34阳性细胞出现, PAS阳性物质呈颗粒状弥散分布在浆液性卵巢癌细胞浆内，有的贴附在管腔内侧。卵巢癌细胞分泌PAS阳性物质，可能参与构建肿瘤的血管基质重塑。

　　有研究表明能形成血管生成拟态的恶性黑色素瘤细胞的基质金属蛋白酶在形成血管生成拟态的区域内表达水平增高，MMP2对恶性黑色素瘤细胞形成血管生成拟态起着重要作用[5]。肿瘤细胞在形成血管生成拟态的过程中，肿瘤细胞与细胞外基质相互作用，使细胞外蛋白水解、重塑成可以运送血液的微循环管道样结构基质。MMP2是一种细胞外蛋白水解酶，主要由肿瘤细胞、成纤维细胞和炎性细胞分泌，研究表明其在肿瘤介导的细胞外基质降解中起关键作用，与肿瘤细胞侵袭转移能力密切相关。在血管生成过程中，增生内皮细胞的迁移需要血管基底膜和细胞外基质的降解，MMP2可作为肿瘤血管生成的调控因素参与肿瘤血管生成。Anil等[6]用免疫组织化学分析显示卵巢癌细胞形成的网络样结构散在表达金属基质蛋白酶MMP1, MMP2, MMP9，膜型金属基质蛋白酶MT1-MMP，应用MMP抑制剂可阻止VM形成。

　　本实验比较了MMP2在卵巢癌腹腔移植瘤中央区域和边缘区域组织的表达差异，发现肿瘤中央区域的MMP2在mRNA水平和蛋白水平表达均高于肿瘤边缘区域的表达。MMP2与VEGF在肿瘤血管生成中起着协同作用，肿瘤中央区域受血液供应影响，缺氧状态比肿瘤边缘区域严重，肿瘤组织局部缺氧导致肿瘤细胞释放VEGF[7]，VEGF 以旁分泌的方式作用于周围的内皮细胞表面，引起内皮细胞的有丝分裂增加，同时刺激内皮细胞分泌MMP2，上调MMP2活性，降解内皮细胞周围基质，促进内皮细胞迁移，进而形成新生血管。MMP2表达是否与卵巢癌血管生成拟态形成有关，由于样本例数较少，仍需今后进一步研究。

　　【参考文献】

　　[1] 赵静, 黄江生, 杨爱军, 等. 肝细胞癌中血管生成拟态的三维细胞培养及组织学研究[J].癌症, 2007, 26(2) : 123-126.

　　[2] Sun B, Zhang, S, Zhang D, et al. Vasculogenic mimicry is associated with high tumor grade, invasion and metastasis, and short survival in patients with hepatocellular carcinoma[J]. Oncol Rep, 2006, 16(4): 693-698.

　　[3] Zhang S, Zhang D, WangY, et al. Morphologic research of microcirculation patterns in human and animal melanoma[J]. Medical Onclogy, 2006,23(3): 403-409.

　　[4] 孙保存, 张诗武, 陈莉, 等. 恶性黑色素瘤血管生成拟态的体内外实验和超微结构研究[J]. 中国肿瘤临床, 2004, 31(9): 489-492.

　　[5] 张凡，孙保存，赵秀兰，等. CD31、MMP2、MMP9、CathepsinD对小鼠黑色素移植瘤血管生成拟态中作用的研究[J].河北北方学院学报(医学版), 2005, 22(6): 5-13.

　　[6] Anil KS, Mavis S, Fletcher MD, et al. Functional role of matrix metalloproteinases in ovarian tumor cell plasticity[J]. Am J Obstet Gynecol， 2004,190(4):899-909.

　　[7] 施健飞，施公胜，黄剑飞，等.nm23，血管内皮生长因子在卵巢癌中的表达及临床意义[J].南通医学院学报，2001，21(4)：359-362.