胆管上皮细胞表达TGF-茁在胆汁淤积性肝病中的作用

　　【摘要】 【目的】 通过研究胆汁淤积性肝病不同阶段的肝脏病变、BDEC增殖及转化生长因β(TGF-β)的变化，以探讨胆汁淤积性肝病发生发展的可能机制。【方法】 ①以胆总管结扎(BDL)制作胆汁淤积性肝病大鼠模型，分为正常对照组(D0)、7天组(D7)及18天组(D18);②动态观察不同时间点大鼠肝脏病理变化，以Knodell组织学评分评价肝脏组织学改变;③自肝脏中分离BDEC，以实时定量PCR方法(RT-PCR)检测不同时间点肝脏组织以及分离所得BDEC中TGF-β表达的情况;④分析肝脏Knodell组织学评分与TGF-β1 mRNA表达水平间的相关性;⑤利用永生化的小鼠肝内胆管上皮细胞株(mIBEC)，通过体外实验探讨TGF-β1对mIBEC增殖的作用。 【结果】 ①肝脏Knodell组织学评分随着淤胆时间延长而增加(P < 0.01)，且胆管增殖程度随着淤胆时间延长而加重;②肝脏组织及BDEC中TGF-β1、TGF-β2及TGF-β3的mRNA表达水平随着淤胆时间延长而显著上调;③肝脏Knodell组织学纤维化程度评分与不同时间点肝脏组织及BDEC中TGF-β1 mRNA表达水平间存在正相关(r = 0.9376，P < 0.05及r = 0.9682，P < 0.01)。④体外研究显示，TGF-β1可抑制mIBEC增殖。【结论】 ①BDL诱导的胆汁淤积性肝病中，肝脏损伤、胆管增殖程度及TGF-β mRNA表达水平均随淤胆时间延长而增加;②TGF-β1与BDEC的相互作用在BDL诱导的胆汁淤积性肝病发生发展中起着重要作用;③增生的BDEC中TGF-β1表达上调参与了BDL诱导的胆汁淤积性肝纤维化形成。

　　【关键词】 胆管上皮细胞; 转化生长因子β; 胆汁淤积性肝病; 大鼠

　　Role of TGF- Expressed by Biliary Epithelial Cells in Pathogenesis

　　of Cholestatic Liver Disease

　　HE Yao， CHEN Bai-li， YANG Rong-ping， ZENG Zhi-rong， REN Ming

　　(Department of Gastroenterology， The First Affiliated Hospital， Sun Yat-sen University， Guangzhou 510080， China)

　　Abstract： 【Objective】 To investigate the change of liver histology， proliferation of BDEC， and expression of TGF-β in different stages of liver cholestasis. 【Methods】 ①Rat cholestatic livers were induced by common bile duct ligation (BDL) and separated into 3 groups， namely control group (D0)， 7 days after BDL group (D7)， and 18 days after BDL group (D18). ② Histological changes of livers in different groups were evaluated based on Knodell HAI score. ③ Real-time PCR was used to detect the expression of TGF-β in liver tissue and isolated BDEC in different groups. ④ Statistically analyzing the correlation between Knodell HAI score and the levels of TGF-β1 mRNA. ⑤ In vitro study was performed to investigate the effect of TGF-β1 on an immortalized mouse intrahepatic bililary epithelial cell line (mIBEC). 【Results】 ① Knodell HAI score and the proliferation of intrahepatic bile ducts increased as the liver cholestasis aggravated. ② The levels of TGF-β1， TGF-β2， and TGF-β3 mRNA were significantly up-regulated in liver tissues and BDEC as the liver cholestasis aggravated. ③ Positive correlation was found between Knodell fibrotic score and the levels of TGF-β1 mRNA in liver tissues and BDEC(r = 0.9376， P < 0.05 and r = 0.9682， P < 0.01). ④ In vitro study showed that TGF-β1 inhibited the proliferation of mIBEC. 【Conclusion】 ① Liver injury， biliary proliferation， and the levels of TGF-β mRNA expression increased as liver cholestasis aggravated. ② The interaction of TGF-β1 and BDEC plays an important role in the pathogenesis of BDL induced cholestatic liver disease. ④ Up-regulated expression of TGF-β1 mRNA in the proliferated BDEC participates in the formation of BDL induced cholestatic liver fibrosis.

　　Key words： biliary duct epithelial cell; TGF-β; cholestatic liver disease; rat

　　[J SUN Yat-sen Univ(Med Sci)，2010，31(1)：85-90;99]

　　转化生长因子β(transforming growth factor β， TGF-β)是一组多功能的肽类生长因子，有三种异构体，分别为TGF-β1、TGF-β2及TGF-β3。TGF-β可作用于多种细胞发挥多种功能，如调节免疫、细胞增生、分化、凋亡，刺激细胞外基质形成、导致器官发生纤维化等，在正常上皮细胞及癌变早期阶段充当抗细胞增殖因子的角色[1]。胆汁淤积性肝病在临床上较为常见，可由多种病因引起，常伴有明显的肝内胆管增生，最终可进展至胆汁淤积性肝纤维化[2]。而在各种肝脏纤维化疾病中，TGF-β1是诱导细胞外基质沉积的主要刺激因子[3]。肝内胆管增生是长期肝内淤胆后显著的病理变化之一。免疫组化研究发现胆管上皮细胞(biliary duct epithelial cells， BDEC)表达的TGF-β在原发性胆汁淤积性肝硬化患者(PBC)肝移植术后复发中起着重要作用[4];Lu等[5]报道在损伤及增殖的BDEC中发现TGF-β1， 2， 3的高表达。提示增生的BDEC中高表达TGF-β在淤胆性肝病发病机制中起着重要作用。最近的研究进一步发现，STAT5-TGF-beta-STAT3信号网络的失调及Smad3介导的信号传导异常在慢性肝纤维化及肝癌发生中可能起着重要作用[6-7]，进一步提示TGF-β在肝纤维化的形成中可能起重要作用。由上可见，在胆汁淤积性肝病中，肝内胆汁淤积-肝内BDEC增生-TGF-β表达水平增加-肝纤维化，这些病理生理状态之间存在着密切的关系。因此，我们拟采用胆总管结扎制作的肝内胆汁淤积的大鼠动物模型及永生化的小鼠胆管上皮细胞株(immortalized mouse intrahepatic bililary epithelial cell line，mIBEC)，研究胆汁淤积性肝病发展不同阶段，BDEC增生与TGF-β表达之间的关系，以及TGF-β对BDEC的作用，探讨TGF-β在胆汁淤积性肝纤维化发生发展中的作用及可能机制。

　　1 材料和方法

　　1.1 胆总管结扎大鼠动物模型

　　雄性F344 大鼠18 只，购自Harland Sprague Dawley(Indianapolis，IN)，于美国洛杉矶Cedars-Sinai Medical Center动物饲养。体质量200 ～ 250 g，分为3 组，每组6 只，即对照组(D0)、胆总管结扎术后7 d组(D7)及胆总管结扎术后18 d组(D18)。大鼠麻醉后开腹，双重结扎胆总管后，断离胆总管，胆管结扎动物模型即成功建立[8]。对照组大鼠则予开腹后轻触胆总管后即关腹。

　　1.2 分离肝间质细胞及胆管上皮细胞

　　于胆管结扎术后7 d 和18 d 分别处死大鼠，其中实验组6只，对照组3只。取小块肝脏组织浸入10%中性福尔马林中固定，石蜡包埋，5 ?滋m 切片进行常规HE染色和后续免疫组化染色; 部分快速冷冻，用于提取RNA进行RT-PCR;其余肝组织用于分离肝间质细胞。

　　1.2.1 分离肝间质细胞 本实验首先采用两步灌注及梯度离心法分离得到肝脏中所有的细胞[9]。以PBS洗涤该悬于胶原酶溶液中的总肝脏细胞3 次，随后以50 × g的速度离心2 次以除去肝细胞。所留上清再以350 × g的速度离心以获取肝间质细胞(non-parenchymal liver cell，NPLC)。

　　1.2.2 分离BDEC 采用密度梯度离心法自NPLC中分离BDEC，方法如下[10]：以32% Percoll(溶于Leibovitz L-15细胞培养液中)重悬上述所得的肝间质细胞。将4 mL上述细胞悬液轻置于不同浓度梯度的Percoll层上(4 mL 50% Percoll和4 mL 90% Percoll)，于4 ℃以 2 000 × g的速度离心12 min。分布于1.065 g/cm3 与1.075 g/cm3 间的细胞即富含BDEC。分离所得BDEC后，采用小鼠抗大鼠细胞角蛋白7(CK7，购自Abcam公司，1：200稀释)单抗为一抗，藻红蛋白(PE，565/578 nm)结合的驴抗小鼠IgG多抗为二抗(购自Abcam公司，1：300稀释)对分离所得细胞进行染色，随后以流式细胞技术进行其纯度鉴定。以台盼蓝染色检测细胞存活率。

　　1.3 肝脏病理组织学及免疫组化检查

　　肝脏石蜡切片分别以HE及天狼星红(Sirius red)染色后于显微镜下观察肝脏组织学变化，采用Knodell组织学评分系统对肝脏进行组织学评分[11]。采用肝脏冰冻切片(6 um)以小鼠抗大鼠细胞角蛋白7(CK7，购自Abcam公司，1：200稀释)单抗为一抗，藻红蛋白(PE，565/578 nm)结合的驴抗小鼠IgG多抗为二抗(购自Abcam公司，1：300稀释)进行免疫荧光染色显示肝内BDEC。

　　1.4 实时定量PCR

　　采用RNeasy Mini 试剂盒 (Qiagen， Valencia， CA. www1.qiagen.com)分别自大鼠肝组织及BDEC中提取RNA，以500 ng所提取RNA为模板进行逆转录PCR获取cDNA模板。采用QuantiTect SYBR Green PCR 试剂盒 (Qiagen)，TaqMan ABI PRISM 7300 实时 PCR 系统(Applied Biosystems， Foster City， CA)对来自大鼠肝脏组织及不同时间点的BDEC的cDNA模板进行定量扩增。所用引物如表1。每次进行PCR扩增时均采用等量的蒸馏水替代模板作为阴性对照，而采用 3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH) 作为加样对照。所测目标基因mRNA的绝对值可通过以其GAPDH mRNA含量进行较正而获得。每个样本均重复检测三次。为排除非特异性扩增，对所有样本的扩增产物均以2%琼脂胶电泳进行鉴定。分析TGF-β1 mRNA表达水平与肝脏Knodell组织学评分的相关性。

　　1.5 TGF-β1对胆管上皮细胞增殖的作用

　　1.5.1 细胞培养 采用6孔培养板进行细胞培养，以TGF-β1 (1 ng/mL， R&D UK)与mIBEC共同孵育。以不加TGF-β1细胞因子为对照。mIBEC培养液为1 份DMEM(dulbecco?蒺s modified eagle Medium)、1 份F12 培养液、10 mL/L 胎牛血清(fetal bovine serum， FBS)及抗生素[12]。分别于细胞种植后2 h、24 h、48 h、72 h、及96 h收集细胞测定Ki67基因的表达。

　　1.5.2 细胞增殖试验 采用96孔培养板进行细胞培养。以TGF-β1(1 ng/mL， R&D UK)与mIBEC (104/孔)共同孵育，采用含10 mL/L FBS的mIBEC培养液。 以无TGF-β1的mIBEC(104/孔)培养板为对照。自24至96 h分别于选定的时间点(24 h、48 h、72 h、及96 h)收集该的胆管上皮细胞。采用CellTiter 96?誖 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay(Promega Corporation， Madison， WI)，以比色法测定细胞数，测定细胞增殖。

　　1.6 统计学处理

　　实验结果以均数 ± 标准差表示。采用医学统计软件(MedCalc， Belgium)进行统计分析，采用Mann-Whitney试验检验结果的显著水平。

　　2 结 果

　　2.1 肝脏病理组织学及免疫组化检查

　　如表2所示，肝脏Knodell组织学活动指数(HAI)评分随着淤胆时间延长而增加，胆管增殖程度亦随着淤胆时间延长而加重(图1)。

　　2.2 肝脏组织中及胆管上皮细胞中TGF-β表达水平

　　本实验分别检测了胆汁淤积发生前及发生后的不同时间点(第0天、第7天及第18天)肝脏组织及BDEC中TGF-β1、TGF-β2及TGF-β3 mRNA表达水平的变化。如图2所示，正常肝组织及BDEC主要表达TGF-β1，仅表达极低水平的TGF-β2，而几乎不表达TGF-β3。而随着胆汁淤积的发生及时间延长，肝脏组织及BDEC中的TGF-β1、TGF-β2及TGF-β3 mRNA表达水平均逐渐增加，在D18组及D7组均显著高于D0组，且D18组高于D7组。而其中以TGF-β1表达水平最高，TGF-β2其次，TGF-β3最低。

　　2.3 肝脏Knodell组织学评分与TGF-β1 mRNA表达水平的相关性

　　分析肝脏Knodell组织学评分与不同时间点肝脏组织及BDEC 中TGF-β1 mRNA表达水平间的相关性，我们未能发现肝脏Knodell组织学评分与不同时间点肝脏组织及BDEC中TGF-β1 mRNA表达水平间的存在相关性(r = 0.7649及r = 0.8239，P > 0.05)。但当进一步分析肝脏Knodell组织学评分中纤维化程度与不同时间点肝脏组织及BDEC中TGF-β1 mRNA表达水平间的相关性时，我们发现两者之间均存在正相关(r = 0.9376，P < 0.05及r = 0.9682，P < 0.01)。

　　2.4 TGF-β1抑制胆管上皮细胞增殖

　　本研究通过RT-PCR方法检测TGF-β1作用后mIBEC中Ki67 mRNA表达情况，以及通过细胞增殖试验检测TGF-β1作用后mIBEC增殖情况，评价TGF-β1对mIBEC的作用。如图3A所示，mIBEC中Ki67这一反映细胞增殖基因的表达在TGF-β1作用后24至72 h显著下调。由图3B中可见，TGF-β1作用后48 h及72 h，细胞增殖率显著低于对照组。

　　3 讨 论

　　3.1 胆汁淤积性肝病模型建立

　　本研究通过胆总管结扎机械阻断胆汁流后成功地制作了肝脏胆汁淤积大鼠动物模型，病理上特征地表现为肝内胆汁淤积、胆管增生、汇管区炎症、纤维间隔形成，结果与文献报道一致[13]。我们采用Knodell组织学评分系统评估胆汁淤积发生不同时间(D0、D7、及D18)肝脏组织学的变化，发现随着淤胆时间延长，肝脏损伤程度加重。在BDL术后第7天肝内胆管出现明显增殖，且其程度亦随着淤胆时间延长而加重。结果表明，本模型较好地反映了胆汁淤积性肝病的发生发展过程。

　　3.2 TGF-β1在肝纤维化过程中的作用

　　肝内胆管增殖是BDL诱导胆汁淤积性肝病突出的病理改变之一，肝纤维化是其发展的最终主要结局之一，然而胆道病变与肝纤维化间的关系仍未明确。已证实组织损伤后TGF-β长时间过度表达可诱导纤维增生及ECM积聚，从而导致重要器官的纤维化[14]。在淤胆性肝病中，TGF-β1可从转录水平刺激活化的肝脏星状细胞(hepatic stellate cells， HSCs)表达胶原基因，从而分泌细胞外基质[15]。在肝纤维化或肝硬化患者中，肝纤维化的严重程度与患者血浆中TGF-β1浓度显著相关[16]。采用抗TGF-β中和抗体可抑制ECM的积聚[17]。通过阻断TGF-β表达进行干预可防止实验动物发生肝纤维化[18]。这些研究结果均提示，TGF-β1在肝纤维化发生中起着重要作用。Lewindon等[19]发现在肝脏囊性纤维化病变中，在胆管上皮细胞中可见TGF-?茁蛋白及TGF-β1 mRNA的显著表达，且TGF-β1表达水平与肝纤维化及汇管区组织学异常程度间存在显著相关性，提示损伤的胆管上皮细胞分泌的TGF-β在肝纤维化形成中可能起着重要作用。异常的胆道生理可通过包括TGF-β在内的各种神经内分泌途径调控肝脏的损伤修复以及纤维化进展过程，而胆管上皮细胞增生则是其中的关键[20]。在受损胆管周围存在显著纤维增生这一发现，亦进一步支持这一假设[21]。然而胆汁淤积、胆道系统受损、及纤维化发生发展这些因素间的相互关系仍未完全明确。我们采用BDL诱导的胆汁淤积大鼠动物模型动态研究胆汁淤积发生不同时间点的TGF-β1、TGF-β2及TGF-β3 mRNA表达水平的变化，结果发现，在正常肝组织及BDEC中上述TGF-β mRNA均仅有极微弱的表达，而随着淤胆时间延长、胆管增生加重，它们的表达水平显著上调并随病变程度加重而增加，其中尤以TGF-β1的表达水平最高。本研究不但证实了TGF-β表达上调在胆汁淤积性肝病发生发展中起着重要作用，更进一步通过分离BDEC直接证实增生的BDEC亦可通过TGF-β表达上调在胆汁淤积性肝病发生发展中起作用。

　　为进一步明确TGF-β1在肝脏胆汁淤积病变发生发展中的地位，我们分析了不同时间点肝脏组织及BDEC中TGF-β1 mRNA表达水平与肝脏Knodell组织学评分间的相关性，结果未能发现两者间存在相关性;但当进一步分析TGF-β1 mRNA表达水平与肝脏纤维化程度评分间的相关性时，结果发现两者间存在正相关，为TGF-β1表达与肝脏纤维化形成间的关系提供了直接证据。已有文献报道，在缺乏TGF-β1上调的情况下，即使肝脏出现炎性损伤，亦不会出现伴随的纤维原性刺激及胶原的沉积[22]。我们的研究不但证实了胆汁淤积性肝病中存在TGF-β表达上调，而且发现增生的BDEC是表达TGF-β的重要细胞来源之一，并揭示了TGF-β1在BDL诱导的胆汁淤积性肝纤维化发病机制中的肯定作用。

　　为直接显示TGF-β1与胆管上皮细胞间的相互作用，我们采用了mBDEC与TGF-β1进行体外共同培养，直接显示了TGF-β1对胆管上皮细胞增殖的抑制作用。与文献报道的TGF-β1可抑制上皮增生，阻止上皮发生癌变，并在抑制非典型胆管增殖、诱导凋亡中起着一定的作用等研究结果相符[23]。从动物在体研究中我们发现随着淤胆及胆管增生的加重，BDEC表达TGF-β上调，而体外研究我们却发现TGF-β1可抑制mBDEC的增殖，我们推测增生胆管上皮细胞中上调表达的TGF-β1对胆管上皮细胞增生可能起着负反馈作用，从而抑制其增殖。

　　综上所述，本实验通过对BDL诱导的胆汁淤积性肝病发生发展不同时间点的研究，证实了TGF-β表达上调在该病发病中的起着重要作用，增生的BDEC是表达TGF-β的重要细胞来源之一，并显示了TGF-β1在该病肝纤维化形成中的肯定作用。结合在BDL诱导的淤胆性肝病中胆汁淤积、胆管增殖是其突出特点这一特征，我们推测淤胆对BDL后肝纤维化发生有着重要的影响，但其机制究竟是通过胆盐潴留、亦或由于感染等其他因素共同的刺激、还是其它的不明刺激因素在其中起作用，仍需进一步研究探讨。

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