β-巯基乙醇和bFGF分别诱导大鼠骨髓基质干细胞成神经元样细胞的生物学性状

　　【摘要】 【目的】 比较β-巯基乙醇(BME)和bFGF分别诱导大鼠骨髓基质干细胞(MSC)所分化神经元样细胞的生物学性状。 【方法】 BME和bFGF分别作用于大鼠的MSC，分别于9 h和5 d后，进行神经元样细胞的细胞计数，然后用免疫荧光进行神经元特异性蛋白NF200的鉴定，RT-PCR的方法分析神经元特异性基因NF的表达;Western blotting对检测神经元特异性蛋白NF200的表达。【结果】 BME诱导的细胞在加入药物1 h后形态发生改变，9 h时有突起伸出，胞体变亮; bFGF诱导的细胞在诱导后第3天开始有突起伸出，呈神经元样，第5天突起之间相互连接，第7天胞体死亡;而两种药物所分化的神经元样细胞NF200的免疫荧光均成阳性，但bFGF诱导的神经元样细胞的阳性率要显著高于BME所诱导的神经元样细胞; 在RT-PCR中，bFGF诱导的神经元样细胞神经元特异性基因NF200的表达要高于BME所诱导的细胞; western blotting中，bFGF诱导的神经元样细胞神经元特异性蛋白NF200的表达要高于BME所诱导的细胞。 【结论】 bFGF和BME均可诱导MSC分化为神经元样细胞。但bFGF所诱导的神经元样细胞在从形态上更接近于神经元，而神经元特异性基因NF200 mRNA及神经元特异性蛋白NF200蛋白的表达，均高于BME所诱导的细胞。

　　【关键词】 骨髓基质干细胞; 神经元; 诱导

　　Biologic Characteristic Study of β-mercaptoethanol and bFGF to

　　Induce Rat Mesenchymal Stem Cells to Neuron-like Cells

　　FENG Ying1， WANG Hui-jun2， HUANG Jin-tao1， XIE Fu-kang1

　　(1. Department of Histology and Embryology， Sun Yat-sen University， Guangzhou 510080， China;

　　2. Department of Obstetrics and Gynecology， Central Hospital of Yellow River， Zhengzhou 450004， China)

　　Absract： 【Objective】 To compare the biological characteristics of neuron-like cells from rat mesenchymal stem cells (MSC) induced by β-mercaptoethanol (BME) and basic fibroblast growth factor (bFGF) respectively. 【Method】 BME and bFGF were added to rat MSC respectively for 9 h and 5 days. The neuron-like cells from MSC with the neuron specific protein NF200 were identified using immunofluorescence. The gene expression of NF were analyzed using RT-PCR and the protein expression of NF200 were analyzed using Western blotting. 【Results】 MSC induced by BME appeared morphology change in an hour and the neurite can be seen at six hour. Some cell bodies became lighter and died. MSC induced by bFGF had neurite in the third day， and appeared network structure in the fifth day， then cells died in the seventh day. At the same time， The result of immunofluorescence showed the NF200 expression of neuon-like cells induced by two ways were both positive， but MSC induced by bFGF were stronger than those induced by BME. The results of RT-PCR and western blotting were same as that of immunofluorescence. 【Conclusion】 Both bFGF and BME can induce rat MSC to neuron-like cells， but the neuon-like cells induced by bFGF were more like real neurons in morphology and expression of neuron specific protein and mRNA.

　　Key words： mesenchymal stem cells; neuron; induction

　　[J SUN Yat-sen Univ(Med Sci)，2010，31(1)：28-32]

　　骨髓基质干细胞(mesenchymal stem cells， MSC)是具有多向分化潜能的细胞，可分化成人体各个胚层的组织。如已得到确认的骨、软骨、肌键、肌肉和心肌细胞等。而外胚层的组织如皮肤、神经细胞、眼和毛发等也有报道。同时，内胚层的细胞如肝、肺、胰腺、消化道等器官的细胞据报道也可来源于骨髓基质干细胞[1]。目前认为，骨髓基质干细胞可向神经元方向分化，并且诱导方法有很多种，如Woodbury等[2]用β-巯基乙醇(BME)等可诱导骨髓基质干细胞向神经元方向分化，Sanchez-Ramos等[3]用含RA(维甲酸)和EGF(表皮细胞生长因子)的培养基诱导骨髓基质干细胞向神经元方向分化。Tropel等[4]报道用bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)可诱导MSC向有功能的神经元分化，还有国内用中药诱导MSC分化为神经元样细胞。虽然有如此多的诱导方法，但目前对所得到的神经元样细胞存在很多争议。他们是否真的具有神经元的形态和蛋白表达?是否具有神经元的部分功能?为解决这些问题，本实验选择BME和bFGF诱导大鼠骨髓基质干细胞向神经元样细胞分化， 比较这两种方法所诱导的神经元样细胞在形态及神经元特异性蛋白的表达和基因的mRNA表达是否有差异。

　　1 材料和方法

　　1.1 大鼠MSC的分离培养和鉴定

　　质量50 g左右SD大鼠，引颈处死，剪开后肢皮肤，分离组织，取出股骨，1 mL注射器吸取正常培养基冲出骨髓。Percoll(密度1 073 g/L)分离，将抽取的骨髓加入等量的无血清L-DMEM充分混匀，转入离心管，500 × g 离心5 min，弃上清及脂肪层，沉淀用无血清L-DMEM 充分混匀，轻轻叠加到密度为1 073 g/L Percoll 分离液上，1 200 × g 离心30 min，收集单核细胞层，DMEM 洗涤两次。收集细胞沉淀， 用体积分数15%的胎牛血清(FBS)的α-MEM培养基重悬，调整细胞密度，按1 × 106 cells/cm2 密度接种。37 ℃， 体积分数为5% CO2 培养箱培养。3 d换液一次。待细胞铺满瓶底，1.25 g/L胰酶加0.2 g/L EDTA消化后，完全培养基终止消化，按照1：2比例传代培养。将培养的第3代骨髓基质干细胞加入成骨诱导液(10% FBS L-DMED内含0.1 μmol/L的地塞米松、50 μg/mL维生素C、10 mmol/L β-磷酸甘油)进行成骨诱导3周，3 d换液。21 d Von Kossa?蒺s矿化结节染色法鉴定。同时，将第3代骨髓基质干细胞加入成脂诱导液(A液：1 mmol/L地塞米松，0.5 mmol/L IBMX，10 μg/mL的胰岛素，0.2 mmol/L的吲哚美辛;B液：10 μg/mL的胰岛素。前3 d加A液、B液1 d、A液3 d，再换B液，依此3个循环.)，油红染色鉴定(图1)。

　　1.2 MSC向神经元分化的诱导

　　取第3代骨髓基质干细胞，以2 × 104 cells/ cm2的密度接种于细胞培养板中。分别加入含10%FBS的L-DMEM、无血清L-DMEM(内含1 mmol/L BME)、含10%FBS 和25 ng/mL bFGF的L-DMEM (接种细胞前用10 μg/mL多聚赖氨酸包被)。BME诱导的MSC 9 h时终止诱导，拍照;bFGF诱导的MSC 诱导5 d后拍照。

　　1.3 免疫荧光鉴定和神经元阳性细胞百分比

　　正常培养的大鼠MSC、无血清L-DMEM和1 mmol/L BME诱导9 h的MSC及10%FBS 和25 ng/mL bFGF诱导5 d的MSC分别加入4%多聚甲醛固定，PBS洗涤，加入抗小鼠的NF200单克隆抗体，孵育过夜，然后加入兔抗大鼠IgG(FITC标记)常温下2 h。DAPI核荧光染色10 min，PBS洗涤，甘油封片。荧光显微镜观察，拍照，选取3个视野，对NF 200 阳性细胞进行计数，然后对比核荧光染色的阳性细胞数，计算分化百分率。SPSS进行统计学分析。

　　1.4 RT-PCR

　　以上述诱导方式收集正常培养的大鼠MSC、无血清L-DMEM和1 mmol/L BME诱导9 h细胞及10%FBS 和25 ng/mL bFGF诱导5 d的细胞，Trizol提取细胞总RNA。以3种细胞的总RNA为模板，用NF的引物进行RT-PCR扩增。β-actin用作内参。实验结果重复3次。

　　1.5 Western blotting

　　收集3组细胞，抽提液抽提蛋白，按照Western blotting基本步骤跑胶、转膜，加一抗(抗小鼠的NF200单克隆抗体)、二抗，显影，扫描。实验结果重复3次。

　　2 结 果

　　2.1 骨髓基质干细胞的培养及鉴定

　　经成骨和成脂诱导后， Von Kossa?蒺s矿化结节染色和油红染色均呈阳性。说明所分离的大鼠骨髓细胞具多向分化潜能，应为MSC(图1)。

　　2.2　MSC向神经元分化的诱导

　　BME和bFGF均可诱导MSC向神经元样细胞分化.BME诱导的细胞在加入药物1 h后细胞形态就发生改变，9 h时细胞有多个突起伸出，胞体变亮，之后细胞漂浮死亡;而bFGF诱导的细胞在诱导后第3天开始出现细胞逐渐变长，有突起出现，且突起明显长于BME诱导所产生的神经元样细胞，第5天神经元样细胞的突起之间相互连接，形成网络状结构，第7天细胞变圆，死亡(图2)。

　　2.3 免疫荧光鉴定和神经元阳性细胞百分比

　　两种诱导剂所诱导的神经元样细胞分别NF200(神经元特异性抗体)抗体的免疫荧光均呈阳性。但bFGF所诱导的神经元样细胞NF200的免疫荧光表达明显强于BME诱导所产生的神经元样细胞，且形态上更为接近神经元(图3)。DAPI进行核荧光染色后，对NF200阳性表达的细胞进行细胞计数。BME诱导的MSC NF200阳性细胞百分比为(30.5 ± 8.6)%，而bFGF所诱导的MSC阳性表达细胞达(64.2 ± 6.5)%，两者存在显著差异(表1)。

　　2.4 RT-PCR

　　RT-PCR结果显示，未经诱导的MSC无NF基因的表达，而BME和bFGF所诱导的MSC表达NF，但bFGF所诱导的MSC表达的NF要高于BME所诱导的MSC(图4)。

　　2.5 Western blotting结果

　　Western blotting结果显示，未经诱导的MSC无NF200蛋白的表达，而β-巯基乙醇和bFGF所诱导的MSC表达NF，但bFGF所诱导的MSC表达的NF要高于β-巯基乙醇所诱导的MSC(图5)。

　　3 讨 论

　　自从2000年Woodbury和Sanchez-Ramos报道MSC在体外可向神经元方向分化之后，有关这方面的研究就成为一个热点[4-6]。多个实验证实，多种方法可诱导骨髓基质干细胞向神经元样方向分化[7]。如Woodbury等[2]报道，在含有BME、 DMSO、BHA(特丁基-4羟基茴香醚)的DMEM的诱导下，MSC开始具有神经元特征。Kim等[8]研究了培养基质在MSC向神经元方向分化中的作用。他用bFGF、NGF(神经营养因子)、RA、不同的培养基和细胞外成分，如层粘连蛋白(laminin)、明胶(gelatine)、胶原(collagen)、纤连蛋白(fibronectin)和多鸟氨酸(polyornithine)作为人MSC的神经诱导剂。其中RA和bFGF与纤粘连蛋白联合应用具有最好的诱导效能。而在国内，黄苓苷、丹参、黄芪、鹿茸等据说都可诱导骨髓基质干细胞向神经元方向分化[9-12]。

　　面对如此多种的诱导方法，有科学家提出质疑：我们所诱导的神经元是否是真正的神经元?还是仅仅是由细胞融合、其它类型的细胞污染或者是细胞毒性所引起的细胞改变[13]。像Woodbury的神经元诱导方案，细胞在几个小时内就可发生明显的形态改变，在如此短的时间内产生新的蛋白质是不太可能的，与分化相关的细胞构架、基因和蛋白表达在短时间的诱导中也不可能发生改变。由营养因子或神经生长因子诱导的神经元样细胞存活时间较长，那他们就具有神经元的特性吗?

　　以往我们的实验曾经用BME诱导骨髓基质干细胞向神经元方向分化，并从蛋白水平及基因水平证实所诱导的细胞有神经元特异性蛋白的表达。难道这些细胞形态的改变仅仅是细胞毒性的一种反应?那么用其它方法所诱导的神经元与之相比有什么分别吗?2006年，Tropel用bFGF诱导MSC 产生了功能性的神经元[9]。于是，本研究采用这两种方法分别诱导大鼠MSC分化为神经元样细胞，并比较其在形态及神经元特异性蛋白和基因表达方面的差异，观察哪种方法可以产生更接近真正意义神经元， 从而在众多纷繁芜杂的方法中选择更为可靠的神经元诱导方案。

　　本研究结果表明，Percoll分离的大鼠骨髓细胞在贴壁生长后可传代向脂肪细胞和成骨细胞分化，因此具有成体干细胞的特性。在向神经元的诱导实验中，BME所诱导的MSC在几个小时之内就可出现神经元样的形态改变，9 h达高峰，12 h左右漂浮死亡;而bFGF所诱导的神经元在第2天细胞开始变长，第5天出现典型神经元的长突起，7 d后有分化的细胞死亡。但BME所诱导的神经元样细胞突起较短，且很快死亡，bFGF所诱导的神经元样细胞的突起较长，且可存活大约1周的时间。因此，在进行免疫荧光鉴定、RT-PCR和Western blotting，本研究分别选择了9 h和5 d作为检测的时间点。在蛋白表达方面，NF200作为神经元特异性的蛋白，在bFGF所诱导的神经元样细胞中高表达，而BME所诱导产生的神经元样细胞中虽有表达，但表达量较低。免疫荧光和western blotting 的结果都证实了这一结论。在基因表达方面，RT-PCR的结果与蛋白表达相似。分析原因，BME所诱导的MSC在短时间出现神经元的形态改变，原因可能是细胞毒性引起的细胞内微管和微丝的破坏，致使细胞出现形态上的改变;并暂时性的表达一些神经元特异性的蛋白，但并不是真正意义上的神经元;而bFGF属于神经营养因子，在1周左右的时间内，它是可能诱导MSC产生神经元的蛋白质，并表达神经元的一些特性，但其是否真正具有神经元的功能，还需要我们进一步从电生理及神经递质的产生等方面进行进一步研究。

　　从以上的实验结果可以看出，BME和bFGF均可诱导MSC向神经元方向分化，并表达神经元特异性的蛋白和基因。但bFGF所诱导的神经元从形态和蛋白表达和基因表达上均有更典型的神经元的特征。因此，bFGF所诱导的神经元样细胞更接近于真正的神经元，而BME所诱导的神经元样细胞有可能是细胞毒性所引起的细胞收缩。但它们是否真正具有神经元的功能，则需要进一步的研究。

　　长期以来，中枢神经系统损伤及退行性疾病(帕金森氏病、老年性痴呆)的治疗一直是人类面临的难题[14]。诱导真正意义上的神经元进行细胞移植将有助于中枢神经系统损伤和退行性疾病的治疗。本实验对比两种诱导方法，找出更优的诱导方法，这将为骨髓基质干细胞向神经元分化的诱导提供实验依据，也为临床中枢神经退行性疾病的治疗提供了理论依据。

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