浙江省汉族人群18-STR基因座的分型资料及其应用

　　【摘要】 【目的】 建立浙江地区汉族人群18个STR基因座(D8S1179、D21S11、D7S820、CSF1PO、D3S1358、TH01、D13S317、D16S539、D2S1338、D19S433、VWA、TPOX、D18S51、D5S818、FGA、PentaE、PentaD、SE33)的遗传多态性数据资料，并探讨18-STR鉴定分析系统在亲子鉴定、产前诊断等领域的应用。 【方法】 对浙江汉族598例无血缘关系个体，采用2组荧光标记STR-PCR复合扩增系统及毛细管电泳基因分型技术，获取18个STR基因座数据资料;在497个亲子鉴定案例中，比较18-STR与15-STR鉴定系统在亲子鉴定和产前诊断中的应用。 【结果】 18个STR基因座基因型频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P > 0.05)。18个STR基因座的杂合度在0.630 ～ 0.942之间，累积个体识别力大于0.9999999999，基因型分布与中国其它地区汉族人群存在差异。与15-STR鉴定系统相比，18-STR鉴定系统更有利于二联体亲缘关系的认定及可疑突变的判断。在胎儿亲子鉴定中偶然发现的1例21三体胎儿在D21S11、PentaD两个STR基因座出现了特征性峰型。 【结论】 18个STR基因座在浙江汉族人群中呈高度多态性，对法医学亲子关系的认定或排除具有较大价值，部分STR基因座的检测也有助于非整倍染色体的产前诊断。

　　【关键词】 浙江; 汉族人群; 短串联重复序列(STR); 遗传多态性; 亲子鉴定; 产前诊断

　　Establishment and Application of 18-STR Database in Han Population

　　from Zhejiang Province

　　CHEN Yan， ZHU Yu-ning， LU Shi-ming， YOU Jian-fei， MA Yu

　　(Department of Laboratory Medicine， Women’s Hospital， School of Medicine ∥ Laboratory of Paternity Test，

　　Judicial Identification Center， Zhejiang University， Hangzhou 310006， China)

　　Abstract： 【Objective】 To construct a database for the genetic polymorphism of 18 STR loci (D8S1179， D21S11， D7S820， CSF1PO， D3S1358， TH01， D13S317， D16S539， D2S1338， D19S433， VWA， TPOX， D18S51， D5S818， FGA， PentaE， PentaD， SE33) in Han population from Zhejiang province. To investigate the application of 18 STR loci in the field of paternity testing and prenatal diagnosis. 【Methods】 Fluorescent dye labeling multiplex STR-PCR， capillary electrophoresis and DNA sequencer GeneScan were adopted in genotyping 598 unrelated samples collected from Han population in Zhejiang province. 18-STR database was established and analyzed. Population comparison was conducted between Han population in Zhejiang province and 8 other population. 15-STR and 18-STR identification system were compared in 497 paternity testing cases. 【Results】 We observed the distribution of 18 STR loci in Han population meet Hardy-Weinberge equilibrium and was different from other 8 population (χ2 test， P > 0.05). Statistical results showed that the heterozygosis (He) ranged from 0.630 to 0.942. The combined power of discrimination was > 0.9999999999. Compared with 15-STR identification system， higher paternity index scores and higher exclusion rate were obtained with 18-STR identification system in dual-case paternity test and mutation identification. One trisomy 21 fetus was found in a prenatal paternity test case which had two characteristic genotypes in 2 STR loci of D21S11 and Penta D. 【Conclusions】 The 18 loci were relatively highly genetic polymorphic in Zhejiang Han population and could be used for paternity testing. Some STR loci could be used in prenatal diagnosis for aneuploidy.

　　Key words： Zhejiang province; Han population; short tandem repeats (STR); genetic polymorphism; paternity testing; prenatal diagnosis

　　[J SUN Yat-sen Univ(Med Sci)，2010，31(1)：122-128]

　　短串联重复序列(short tandem repeat，STR)是人类的一种重要遗传标记，它是2 ～ 7个bp组成的核心序列，经过几次到几十次的串联重复，构成特定的DNA片段并在人群中呈多态性分布。STR具有高度遗传多态性和稳定性，在遗传制图、民族研究、疾病筛选、基因诊断、法医学个体识别和亲子鉴定等方面的研究有重要意义。目前一般商品试剂盒只检测15个STR基因座[1]，用于亲子鉴定(尤其对于二联体)存在着较大风险[2-3]，为保证亲子鉴定结果的准确性和科学性，本研究拟通过分析浙江地区汉族人群18个STR基因座(D8S1179、D21S11、D7S820、CSF1PO、D3S1358、TH01、D13S317、D16S539、D2S1338、D19S433、VWA、TPOX、D18S51、D5S818、FGA、PentaE、PentaD、SE33)的遗传多态性，获取该群体的18-STR数据资料，并在此基础上评估18-STR鉴定系统在亲子鉴定中的应用价值，探讨在产前诊断等领域中的应用。

　　1 材料与方法

　　1.1 标本来源

　　对2006年5月至2009年3月在我实验室进行亲子鉴定的497个案例(包括二联体鉴定344例，三联体鉴定96例及父-母-胎儿的三联体鉴定57例)进行分析，选择其中598例无血缘关系个体(均为浙江地区汉族人)建立18-STR数据资料。标本采用新鲜静脉血/手指末梢血1 ?滋L或羊水1 mL，所有标本采集及检测均经过知情同意并保密所涉及的个体信息。

　　1.2 试剂与仪器

　　采用美国ABI公司的AmpFlSTR?誖Identifiler?誖Kit和美国Promega公司的PowerPlex 16 Monoplex System(Penta D、Penta E)、PowerPlex ES Monoplex System(SE33)kit。ABI9700型PCR扩增仪、ABI310型基因分析仪等。

　　1.3 DNA提取

　　按Chelex-100法[4]提取血液、羊水等标本的DNA。

　　1.4 18-STR鉴定系统分析方法

　　1.4.1 PCR扩增 第1组：采用AmpFlSTR Identifiler Kit检测D8S1179、 D21S11、 D7S820、 CSF1PO、D3S1358、 TH01、 D13S317、 D16S539、 D2S1338、D19S433、 VWA、 TPOX、 D18S51、 D5S818、 FGA等15个基因座。反应体系总体积20 μL，含PCR Reaction Mix 7.7 μL、Identifiler Primer set 4 μL、Taq Gold DNA Polymerase 0.3 μL以及样本DNA 8 μL。在ABI9700型PCR扩增仪上扩增，反应条件：95 ℃ 11 min预变性，然后94 ℃ 1 min、59 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min，循环28次，再60 ℃延伸60 min，最后扩增产物于4 ℃避光保存备用。

　　第2组：采用PowerPlex 16 Monoplex System和PowerPlex ES Monoplex System kit的相关组分，制备同时检测PentaE、PentaD、SE33等3个基因座的复合扩增体系。反应体系总体积20 μL，含10 × buffer 2.2 μL， PentaE Primer 0.5 μL， PentaD Primer 0.6 μL， SE33 Primer 0.7 μL， Taq Gold DNA Polymerase 0.4 μL，H2O 7.6 μL及样本DNA 8 μL。在ABI9700型PCR扩增仪上扩增，反应条件：95 ℃11 min， 96 ℃ 1 min，然后94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、70 ℃ 45 s，循环10次;90 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、70 ℃ 30 s再循环22次，接着60 ℃延伸30 min，最后扩增产物于4 ℃避光保存备用。

　　1.4.2 毛细管电泳及基因分型检测 取Hi-Di Formamide 15 μL， 分子质量标记物0.5 μL，PCR扩增产物1.5 μL，于95 ℃变性3 min，迅速冰冷3 min后置于ABI310型基因分析仪上进行电泳。用ABI PRISM 310 Data Collection Software-Version 3.1.0软件将收集的电泳图谱信息处理成数据信息，使用Gene Mapper ID software V3.2软件，以美国ABI公司及美国Promega公司的等位基因标准物(Ladder)为参照进行样本等位基因分型。

　　1.4.3 DNA测序 采用ABI公司的3100基因分析仪，对等位基因阶梯(allelic ladder)中没有的等位基因(off-ladder allele，OL)进行测序分析，以核实其重复序列的片段长度，并根据国际法医遗传学会等位基因命名原则和Ladder命名。

　　1.5 18-STR数据资料群体多态性分析

　　对598例个体在18个基因座的基因型进行统计，采用美国Promega公司的PowerstatesV12软件(http：//www.promega.com)计算18个STR基因座的等位基因频率、基因型频率、杂合度(He)、匹配概率(PM)、个人识别力(DP)、非父排除率(PE)、多态信息总量(PIC)等群体遗传学指标，并用HWE精确检验软件[5]进行Hardy-Weinberg平衡吻合度检验;用R×C软件(http：//bioweb.usu.edu/mpmbio)比较不同群体间的等位基因频率差异。

　　1.6 18-STR鉴定系统在二联体亲子鉴定中的应用

　　采用18-STR鉴定系统的等位基因频率信息，对238例在15个基因座符合遗传学规律的二联亲子鉴定案例进行亲权指数和亲权概率再分析，与本实验室常规采用的15-STR鉴定系统(ABI商品用试剂盒，AmpFlSTR?誖Identifiler?誖Kit)的结果进行比较。

　　1.7 18-STR鉴定系统在可疑突变案例(15-STR鉴定系统下矛盾基因座小于3个)中的应用

　　对本实验室常规进行鉴定的497案例中出现的12个可疑突变案例(出现2个矛盾基因座的有3例且均为二联体;出现1个矛盾基因座的有9例其中6例为二联体、3例为三联体)，采用18-STR鉴定系统进行重新分析。

　　1.8 18-STR鉴定系统在胎儿鉴定及产前诊断中的应用

　　采用18-STR鉴定系统对57例父-母-胎儿的三联体标本进行回顾性分析。

　　2 结 果

　　2.1 18-STR数据资料

　　598 例无血缘关系浙江汉族个体的18个STR基因座基因型频率分布在0.001 ～ 0.537之间，所有基因座基因型频率分布(表1)均符合Hardy-Weinberg平衡(P > 0.05)。其中，发现了某些在国内尚未见报道的等位基因，如D21S11等位基因33.1，D19S433等位基因14.1，VWA等位基因17.1，PentaE等位基因15.1和SE33等位基因17.1、18.1、29.3、34.2、35.2;另外，也经测序发现了试剂盒检测系统中没有的等位基因(OL)，如D7S820等位基因9.1、10.1、11.1;D13S317等位基因5、PentaE等位基因26等，这些等位基因在广东等地区汉族人群中也有报道[6]。除此之外，某些在其它地区人群中较常见的等位基因却未在浙江汉族中发现，如D21S11等位基因26、FGA等位基因17等(表1)。

　　2.2 18-STR数据库群体遗传学多态性参数统计

　　浙江汉族18个STR基因座的杂合度(He)在0.630 ～ 0.942之间、个体识别力(DP)在0.798 ～ 0.992之间、匹配概率(PM)在0.008 ～ 0.202之间、非父排除率(PE)在0.329 ～ 0.883之间、多态信息含量(PIC)在0.57 ～ 0.94之间(表1)。

　　2.3 浙江人群与其它群体的等位基因频率分布比较

　　所研究的浙江汉族人群与文献报道[6-15]的群体在不同STR基因座上存在基因频率分布差异(表2)：浙江汉族人群在所有相同检测基因座上与广东地区汉族人群[6]、东北地区汉族人群[9]、新加坡华人[14]之间差异有统计学意义(P < 0.05);与华东地区汉族人群[7]比较除TPOX外其余基因座差异有统计学意义(P < 0.05);与四川[8]、河南[10]、北京[12]和香港[13]地区比较在大多数基因座等位基因频率差异有统计学意义(P < 0.05)。

　　2.4 18-STR鉴定系统与传统15-STR鉴定系统在二联亲子鉴定中的应用比较

　　在238例15个STR基因座符合遗传学规律的二联体鉴定中，亲权概率小于99.99%的有36例，占15.1%，增加至18个基因座后，仅有一例亲权概率未达到99.99%，并且亲权概率大于99.999 9%有226例占95%(表3)。

　　2.5 18-STR鉴定系统在可疑突变案例鉴定中的应用

　　12个可疑突变案例在增加了3个STR基因座(即18-STR鉴定系统)检测后，其中4例达到否定标准(三联体：四个及以上基因座不符合遗传学规律;二联体：三个及以上基因座不符合遗传学规律)而得以排除亲子关系，另外8例(均为1个矛盾基因座)未发现新的不符合遗传规律的遗传位点，经计算PI≥10 000，亲权概率已达到99.99%以上，考虑该基因座存在突变。突变基因座有D13S317、 D8S1179、 D2S1338、 VWA、 D7S820、CSF1PO、D8S1179，突变率在0.15% ～ 0.31%之间，详见表4。

　　2.6 1例21三体胎儿标本的检出

　　采用常规的15-STR鉴定系统进行鉴定的57例父-母-胎儿的三联体鉴定中，有一例胎儿标本在D21S11基因座(染色体位置：21q21.1)出现3个独立的等高的峰(图1)，余标本均扩增平衡。在采用18-STR鉴定系统后，该例标本在Penta D基因座(染色体位置：21q22.3)出现了2：1峰高比例的两个峰(图2)，余标本未见异常峰型。该胎儿标本后经本院细胞遗传室采用传统染色体核型分析方法确诊为21三体。

　　3 讨 论

　　3.1 18个STR基因座是浙江汉族人群理想的鉴定系统

　　598例无血缘关系的浙江汉族个体在18个STR基因座的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律，说明本研究结果可以代表浙江汉族人群在上述基因座的群体遗传特征。18个STR基因座杂合度均 > 0.62，多态信息含量均 > 0.55，显示出较高的遗传多态性;18-STR累积个体识别力 > 0.999 999 999 9，累积非父排除率 > 0.999 999 9，基因座突变率在0.001 5 ～ 0.003 1之间，提示18-STR对浙江汉族人群是较理想的遗传鉴定系统，在法医学个体识别和亲子鉴定中有较高的应用价值。另外，与其它群体数据的比较中显示出浙江汉族群体在所研究的18个STR基因座上有其遗传特殊性，因此，本研究资料及数据库的建立还有助于浙江汉族群体遗传学的相关研究。

　　在所建立的18-STR鉴定系统中，SE33基因座尤其值得关注。目前有关SE33基因座的应用及数据报道甚少，国内文献中仅见北京地区汉族人群[11]及广东汉族人群[15]数据。本研究获取了浙江汉族人群的SE33基因座数据，并且发现与北京地区及广东地区汉族人群之间差异有统计学意义(P < 0.05)。在所研究的18个基因座中，SE33的基因型分布最广，等位基因最多，杂合度和个体识别力均为最高，显示了该基因座有极高的遗传多态性，可作为现有法医学亲子鉴定系统和群体遗传学研究的有力补充。

　　3.2 18-STR鉴定系统对法医学亲子关系的认定或排除具有较大价值

　　目前法医学亲子鉴定一般使用商品试剂盒(Identifiler?誖Kit或PowerPlex 16等)检测15个STR基因座，在各基因座等位基因符合遗传规律的情况下，经常出现亲权概率不能达到99.99%的认定水平，尤以二联体亲子鉴定较为多见。本研究中的238例二联体鉴定，如用商品试剂盒检测15个STR基因座，亲权概率不能达到认定标准99.99%有36例(15.1%)，而亲权概率大于99.999 9%只有67例(28.2%)。采用18个STR基因座后，除1例外其余237例均大于99.99%，且大于99.999 9%有226例(95.0%)。由此可见，采用18-STR鉴定系统可使亲子鉴定结果更加可靠，亲缘关系认定更具有科学性。

　　18-STR鉴定系统对亲子关系的排除也非常有价值。STR基因座突变在亲子鉴定中是不容忽视的一个风险因素，因此不能仅凭1个或2个STR遗传标记不匹配而排除亲子关系。在本实验室常规检测(15-STR)中出现的12个可疑突变案例中，其中3例二联体出现2个矛盾基因座在增加至18-STR鉴定后出现了3个及以上矛盾基因座从而排除亲子关系;1例三联体出现1个矛盾基因座在增加至18-STR鉴定后达到了4个矛盾基因座从而排除亲子关系。另外8例矛盾基因座为1个的可疑突变案例在增加至18-STR鉴定后没有出现新的矛盾基因座，计算PI值均大于10 000，然而是否能凭新增的3个STR位点就判定突变还有待进一步探讨。

　　3.3 18-STR鉴定系统中部分基因座有助于非整倍体等染色体异常的产前诊断

　　在胎儿亲子鉴定案例分析中偶然发现的1例21三体胎儿标本值得重视。通过对21号染色体的D21S11、Penta D基因座的比对发现，胎儿父母的21号染色体均为正常二倍体，胎儿样本在D21S11基因座出现了1：1：1等比例峰高的三个峰(图1)，其中两个是母源性的不同大小的片段(杂合性未改变)，另一个是父源性片段;胎儿标本在Penta D基因座出现了2：1峰高比例的两个峰(图2)，其中两个是母源性的相同大小的片段(杂合性降为纯合性)，另一个是父源性片段。结合D21S11基因座(较Penta D接近着丝粒)、Penta D两个基因座的峰型分析，可诊断胎儿为21三体(唐氏综合征)并推断多余的染色体源于母亲减数分裂I期不分离[16]。21三体、18三体(爱德华综合征)是人群中发病率较高的染色体异常疾病，也是目前产前筛查和产前诊断的主要对象，传统的细胞染色体核型诊断方法存在诊断时间长(2 ～ 3周)、技术要求高等问题，已难以满足日益增长的产前诊断需求，STR基因分型技术因其染色体定位明确、检测快速和自动化程度高而有可能成为产前诊断技术的有益补充，本研究的偶然发现也提示采用相关染色体上多态性较高的STR基因座组合检测可以用于诊断非整倍体染色体异常。已有很多文献对STR在产前诊断应用中的可行性做了探讨[17-18]，在国外也已出现了商品化的荧光定量PCR产前诊断试剂盒，当然，用于产前诊断的STR基因座选择和数量是否适合中国人群同样需要进行群体遗传学评估。

　　综上所述，本研究所建立的18-STR鉴定系统及数据资料有助于开展浙江汉族人群的亲子鉴定工作，对产前诊断也有一定的提示价值。

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