骨髓基质细胞培养基对体外脊髓运动神经元的影响

　　【摘要】 目的：体外检测骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)的条件培养基对脊髓运动神经元的影响。方法：体外培养SD大鼠的BMSCs，并收集其条件培养基。实验组脊髓运动神经元用条件培养基培养，对照组用NB培养液。观察两组运动神经元形态学指标，测量细胞突起长度。MTT法检测两组细胞活力。结果：实验组运动神经元的细胞活力、突起长度与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.01)。结论：BMSCs合成和分泌神经营养活性物质对脊髓运动神经元有维持存活和促进突起生长的作用。

　　【关键词】 神经生长因子;骨髓基质细胞;运动神经元

　　The influence of culture fluid of bone marrow stromal cells on spinal cord motor neuron in vitro

　　LIN Weiwei,CHEN Xue,CHEN Ying,et al (Department of Histology and Embryology, School of Medicine of Nantong University, Jiangsu Key Laboratory of Neuroregeneration, Nantong 226001)

　　[Abstract] Objective：To investigate the effects of bone marrow stromal cells(BMSCs) secretory factors on cultured spinal cord motor neuron. Methods：BMSCs were cultured in vitro. The spinal cord motor neurons in experimental group were grown in conditioned medium which was collected from BMSCs cultures (every 72 h);the cells in control group used NB correspondly. Morphological changes of motor neuron were observed under light microscope. Activity of motor neuron was detected with MTT method. Results：Compared with the control group, the cell vitality of motor neuron in experimental group was increased, and the neural growth was also improved. Conclusion：BMSCs secretory factors play an important role in promoting the survival and growth of motor neuron.

　　[Key words] Nerve growth factors;Bone marrow stromal cells;Motor neuron

　　中枢神经系统损伤的修复和保护是神经领域研究的难题,尤其是运动神经元的损伤或变性死亡导致数量的绝对减少是不可逆的。因此，保护尚存的运动神经元。减轻变性神经元受到的损伤对治疗中枢神经系统损伤具有重大意义。

　　现国内外多项研究证实体外培养的骨髓基质细胞(BMSCs)可分泌多种细胞因子,具有直接调节神经干细胞分化、促进神经突起生长的作用[1-3]。体内试验也证实BMSCs的移植具有提高轴突的再生能力、阻止脱髓鞘、促使髓鞘再生和促进脊髓修复等作用[4]。但目前有关BMSCs及其分泌的营养因子在脊髓损伤后的作用及两者之间的关系所知甚少，确切机制尚不清楚，还有很多问题值得我们去研究和探讨。脊髓运动神经元体外培养的过程对神经元也有一定的损伤，本实验旨在观察BMSCs分泌物对神经元体外生长的影响来验证BMSCs的分泌物是否也支持受损运动神经元的存活和分化。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验动物与试剂 新生1天的SD大鼠6只，体重180~200 g，雌雄不拘，由南通大学实验动物中心提供。主要试剂: L-多聚赖氨酸、L-谷氨酰胺、胰蛋白酶、马血清(HS)、Neurobasal medium(NB)、IMDM，胎牛血清(FBS)，分离液(OptiPrep density gradient medium)等(Sigma公司)。实验器材:台式离心机;超净工作台;CO2 恒温培养箱;24孔培养板;96孔培养板;倒置相差显微镜;激光扫描共聚焦显微镜。

　　1.2 方法

　　1.2.1 脊髓运动神经元的体外培养 无菌条件下取新生1 d SD大鼠的腹侧脊髓,0.05%胰蛋白酶消化25 min;150 g/min离心13 min，收集细胞沉淀加入HBSS缓冲液1 ml，将细胞悬液加入分离液中,470 g/min离心20 min，离心后液体分3层，收集中间层细胞，离心去掉细胞碎片。差速贴壁1 h,收获未贴壁而悬浮的脊髓运动神经元，加NB1(含有2%马血清、2%B27、2 mmol/L L-谷氨酰胺)，接种在预先包被有L-多聚赖氨酸(50 μg/ml)的24孔和96孔培养板，进行形态学观察。

　　1.2.2 BMSCs条件培养基的制备 无菌条件下取出成年SD大鼠双侧股骨，用IMDM基础培养液冲出骨髓吹打成单细胞悬液，离心后将细胞沉淀用含20%FBS的IMDM完全培养液悬浮，接种于直径10 cm的塑料培养皿中。培养24 h后,吸弃悬浮细胞。每隔2~3 d换液。原代培养1 W后，细胞贴壁生长并基本融合。用0.125%胰蛋白酶消化，进行传代培养。将传2代的BMSCs以1×105的密度种于6孔培养板中，20% IMDM，37 ℃、5%CO2孵育2 d，洗涤2遍后加入IMDM基础培养液2 ml孵育48 h，取其上清，经0.22 μm孔径的滤膜过滤，去除细胞和细胞碎片后作为BMSCs来源的条件培养基。

　　1.2.3 条件培养基对脊髓运动神经元作用实验 运动神经元以1×103密度种于24孔板中先加入NB1培养2 d后，实验组换用BMSCs条件培养基继续培养，对照组运动神经元用NB培养，隔天换液。分组培养5 d观察神经元的突起长度。每组随机选3个视野,测量每个视野神经元最长神经突起长度。

　　1.2.4 MTT法检测 实验组和对照组(每组各10孔)于96孔板分别培养神经元48 h后，每孔加入MTT(5 mg/ml)4 h,弃培养液,加入二甲基亚枫充分溶解，在37 ℃下放置20 h后，Elx-800全自动酶标仪570 nm波长下测定每孔样品的吸光度(A)值。实验重复3次。

　　1.2.5 非磷酸化的NF-H/M抗体染色鉴定 两组运动神经元分别培养4 d后，用4%多聚甲醛室温固定30 min。PBS清洗3次，然后加入含0.01%TritonX-100，3%BSA，10%羊血清的封闭液，室温1 h。小鼠抗大鼠NF IgG(1∶800)，4 ℃过夜，PBS洗涤，加入抗小鼠IgG -TRITC(1∶800)，室温避光6 h。甘油封片液封片后置于激光扫描共聚焦显微镜下观察拍照。

　　1.2.6 统计学方法 计量资料以x±s表示，用SPSS 10.0软件进行统计分析，P<0.01为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 形态学观察 脊髓运动神经元接种24 h后，绝大多数贴附盖玻片生长，胞体透亮均质呈锥形,有明显突起。实验组运动神经元加入条件培养基第2 d，细胞处于生长旺盛期，神经元胞体丰满，立体感强，呈三角形、多角形，有光晕;第3 d，细胞已形成多极形,胞体与对照组相比胞体较大,表面光滑呈立体隆起,突起清晰;第5 d,实验组细胞突起粗长,分支多，而对照组胞体透亮，生长晕明显，突起较实验组短，相互连接成网(图1)。测量神经元最长神经突起长度，结果显示两组比较差异有统计学意义(P<0.01)，见表1。

　　2.2 细胞活力检测 分组培养神经元48 h后，MTT法测得两组运动神经元活性结果见表1。采用两独立样本t检验，实验组神经元的活性与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01)。

　　2.3 免疫组化染色鉴定 两组细胞非磷酸化的NF-H /M抗体染色，阳性细胞率都达到85%左右。实验组阳性细胞的突起比对照组长,分支多，细胞突起间密集成网(图2)。

　　3 讨 论

　　目前，人们从神经丛、肢芽提取液等或中药提取物中,发现和提纯神经活性物质[5-6]，但这些神经营养物质来源不便，在临床应用有一定困难。有实验发现，BMSCs能支持神经胶质瘤细胞和神经瘤细胞的生长分化[7]。因此,我们利用BMSCs体外易繁殖且分泌天然的神经活性物质的特性，并收集其条件培养基，为我们保护神经元、挽救受损神经元提供了新的方法和途径;同时纯化的BMSCs具有独特的免疫原性,是一种可行的细胞移植治疗的种子细胞，如应用自身的BMSCs可解决应用时的生物安全性问题。

　　本实验体外培养脊髓运动神经元，在第1、2 d用有血清培养基培养，利用血清和B27等营养物质促进神经元贴壁及对体外环境的适应,从第3 d起换用无血清培养,我们发现此法培养的脊髓运动神经元可存活7~9 d ,其中第3~6 d生长状态最佳[8-9]。考虑到对培养细胞进行研究的时间应选择神经元纯度既高且又处于稳定的生长状况良好的时期。因此我们选择分组后培养5 d的神经元进行显微镜下观察，染色，测量神经元突起。

　　本实验观察BMSCs条件培养基对脊髓运动神经元生长的影响，采用MTT法判断运动神经元的细胞活性状况;通过计量细胞突起长度反映神经元的生长状况;非磷酸化的NF-H/M抗体免疫荧光染色运动神经元[10]。结果显示实验组神经元细胞活性增加,突起的平均长度明显增长,与对照组相比差异显著。这均说明BMSCs条件培养基有促进受损运动神经元存活和突起生长的作用。这可能与BMSCs能分泌一些神经营养因子，包括脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、神经营养因子-3(neurotrophin-3, NT-3)、神经胶质细胞源性神经营养因子(Glial cell-line-derived neurotrophic factor,GDNF)等有关这些因子均被认为能保护神经元减少神经元损失,促进神经的生长发育及髓鞘形成和轴突的再生[1，11-12]。这其中，BDNF可促进轴突再生;GDNF被认为在促进运动神经元的轴突生长，保护受损运动神经元的存活方面起重要作用[13-15]。我们制备BMSCs条件培养基时，既考虑到BMSCs在无血清培养液中生长时间不能太久，又要考虑血清中天然的促细胞分裂因子会使分裂性细胞大量增殖,从而严重影响到神经元的纯度，综合上述原因我们选用同一批次培养的P2代BMSCs，用IMDM基础培养液孵育48 h作为条件培养基。

　　此研究期望会为BMSCs体内修复脊髓损伤提供一些理论依据，从而进一步为脊髓损伤的治疗开拓一些新方法和新思路。至于BMSCs分泌物中哪些活性物质，发生作用如何作用等，还需作进一步研究后才能明确。

　　【参考文献】

　　[1] Kamishina H,Cheeseman JA,Clemmons RM.The effects of canine bone marrow stromal cells on neuritogenesis from dorsal root ganglion neurons in vitro[J].Vet Res Commun,2009，33(7):645-657.

　　[2] 杨晓明，吴红，杨家炯.猕猴骨髓基质细胞的培养及鉴定[J].南通大学学报(医学版)，2008，28(4)：259-260.

　　[3] 王洁，周欣阳，刘炎，等.骨髓基质细胞对背根神经节细胞生长的影响[J].南通大学学报(医学版)，2006,26(6)：399-402.

　　[4] Rooney GE, McMahon SS, Ritter T, et al.Neurotrophic Factor-Expressing Mesenchymal Stem Cells Survive Transplantation into the Contused Spinal Cord Without Differentiating into Neural Cells[J].Tissue Eng Part A，2009,15(10):3049-3059.

　　[5] 朱齐宁,崔静.鼠肢芽提取液及运动对坐骨神经损伤修复的比较[J].中国组织工程研究与临床康复,2007,11(32):4636-4639.

　　[6] 王鸿飞,富灵杰,战丽彬,等.滋补脾阴方药联合牛脑提取液治疗大鼠脊髓损伤实验研究[J].中国康复理论与实践,2005,11(2):96-98.

　　[7] Ho SH,So LH,Lai KO,et al.Induction of NG108-15 cells differentiation by human marrow stromal cells[J].Neuroreport,1998,9(7):1365-1369.

　　[8] He Q，Zhang T,Yang Y,et al.In vitro biocompatibility of chitosan-based materials to primary culture of hippocampal neurons[J]. J Mater Sci Mater Med,2009,20(7):1457-1466.

　　[9] 赵合庆,杨晓玲,严志强.胚胎大鼠脊髓运动神经元的体外培养与鉴定[J].中华神经科杂志,2004,37(5):435-437.

　　[10] Vandenberghe W,Robberecht W,Brorson JR.AMPA receptor calcium permeability, GluR2 expression, and selective motoneuron vulnerability[J].J Neurosci,2000,20(1):123-132.

　　[11] Neuhuber B,Timothy Himes B,Shumsky JS,et al.Axon growth and recovery of function supported by human bone marrow stromal cells in the injured spinal cord exhibit donor variations[J].Brain Res,2005,1035(1):73-85.

　　[12] Crigler L, Robey RC, Asawachaicharn A, et al.Human mesenchymal stem cell subpopulations express a variety of neuro-regulatory molecules and promote neuronal cell survival and neuritogenesis[J].Exp Neurol,2006,198(1):54-64.

　　[13] Stokols S,Tuszynski MH.Freeze-dried agarose scaffolds with uniaxial channels stimulate and guide linear axonal growth following spinal cord injury[J].Biomaterials,2006,27(3):443-451.

　　[14] Chen B,Gao XQ,Yang CX,et al.Neuroprotective effect of grafting GDNF gene-modified neural stem cells on cerebral ischemia in rats[J].Brain Res,2009(1284):1-11.

　　[15] Kameda M,Shingo T,Takahashi K,et al.Adult neural stem and progenitor cells modified to secrete GDNF can protect, migrate and integrate after intracerebral transplantation in rats with transient forebrain ischemia[J].Eur J Neurosci,2007,26(6):1462-1478.