大黄素和黄芪多糖对实验性肝损伤大鼠肝脏超微结构的影响

　　【摘要】 目的 探讨大黄素和黄芪多糖单用及联合应用对肝损伤大鼠肝脏超微结构的影响及意义。方法 采用四氯化碳(CCl4)等复合因素诱导大鼠肝损伤模型。选取清洁雄性SD大鼠90只，随机分为6组：正常对照组(10只)、模型组(20只)、大黄素组(15只)、黄芪多糖组(15只)、大黄素和黄芪多糖联合给药组(15只)、秋水仙碱组(15只)。除正常对照组和单纯造模组外其他各组同时给对应的药物干预，即大黄素40mg/(kg·d)、黄芪多糖200mg/(kg·d)、大黄素40mg/(kg·d)+黄芪多糖200mg/(kg·d)、秋水仙碱0.1mg/(kg·d)，共12周。采集标本后测定肝组织羟脯氨酸(Hyp)含量，电镜观察各组大鼠肝脏的超微结构。结果 大黄素、黄芪多糖单用或联合应用均可以减轻CCl4对大鼠肝脏组织的损伤程度，尤其是联合用药可以明显减少肝组织Hyp含量;保护肝脏的超微结构改变，表现为肝细胞结构接近正常，包膜规整，细胞质内见少量脂滴，线粒体嵴排列规整，内质网增生且明显扩张，肝窦隙可见呈梭形或杆状的肝星状细胞(HSC)，肝窦内充斥少量纤细胶原纤维束，Kupffer细胞脂滴不多。结论 大黄素和黄芪多糖对CCl4致大鼠肝脏的超微结构损伤具有一定的预防保护作用。

　　【关键词】 大黄素;黄芪多糖;肝损伤;超微结构;大鼠

　　Effects of emodin and astragalus polysaccharides

　　on hepatic ultrastructure in rat hepatic injuryZHANG Xin1, DANG Shuangsuo1, CHENG Yanan1,

　　JIA Xiaoli1, CHEN Mingxia2, LIU Enqi3(1. Department of Infectious Diseases, the Second Affiliated Hospital, Medical School of

　　Xian Jiaotong University, Xian 710004; 2. Laboratory of Electron Microscope,

　　Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061; 3. the Experimental Animal Center,

　　Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China)ABSTRACT: Objective To explore the effect and significance of emodin and astragalus polysaccharides (ASP) as well as their combined administration on hepatic ultrastructure in rat hepatic injury. Methods Hepatic injury was induced by multiple factors including carbon tetrachloride (CCl4). Altogether 90 SD rats of clean grade were divided randomly into 6 groups: normal control group (10 rats), model group (20 rats), emodin group (15 rats), ASP group (15 rats), emodinASP combination group (15 rats) and colchicine group (15 rats). The rats were exposed to different concentrations of emodin [40mg/(kg·d)], APS [200mg/(kg·d)], combination drug [emodin 40mg/(kg·d) combined with APS 200mg/(kg·d)] and colchicine [0.1mg/(kg·d)] in parallel by oral gavage (once a day for 12 weeks). At the end of week 12, hydroxyproline (Hyp) content in liver homogenates of all rats were determined. The hepatic ultrastructures of all rats were observed by electron microscope. Results Emodin and APS could ameliorate CCl4induced hepatic injury in rats, especially coadministration of emodin and ASP showed significant prevention of the elevation of Hyp content and protection of hepatic ultrastructure: nearlyormal hepatic cytostructure, regular amicula, manipulus lipid droplet proliferation of intracytoplasm, reduced swelling of mitochondrion, proliferation of endocytoplasmic reticulum, spindle or fusiform hepatic stellate cell and manipulus proliferation of interstitial collagen in sinus hepaticus, and manipulus lipid droplet in Kupffer cell. Conclusion Emodin and astragalus polysaccharides may intervene in CCl4induced hepatic injury in rat hepatic ultrastructure.

　　KEY WORDS: emodin; astragalus polysaccharides; hepatic injury; ultrastructure; rat 本研究采用透射电镜技术，系统观察中药大黄的有效单体——大黄素及黄芪的主要成分——黄芪多糖单用及联合应用对肝损伤大鼠肝脏超微结构的影响，探讨大黄素和黄芪多糖对肝损伤大鼠肝脏组织形态学改变的作用机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 药品与仪器 大黄素(西安天行健天然生物制品集团公司)，纯度98%，临用前用10g/L羧甲基纤维素钠配成12g/L大黄素混悬液;黄芪多糖(西安鸿生生物技术有限公司)，纯度>65%，临用前配成60g/L水溶液;秋水仙碱(云南昆明植物药厂)，蒸馏水配制为10mg/L溶液;四氯化碳(CCl4，西安化学试剂厂)，分析纯，临用前配成400mL/L CCl4橄榄油溶液;胆固醇(西安化学试剂厂)，分析纯。透射式电子显微镜(日本Hitachi公司H600);超薄切片机(瑞典LKB公司LKBⅤ)。

　　1.2 实验动物及分组 雄性SD大鼠90只，3～4月龄，体重(305.88±18.03)g，购自西安交通大学医学院实验动物中心。动物适应性喂养1周后，随机分为6组：正常对照组(10只)、模型组(20只)、大黄素组(15只)、黄芪多糖组(15只)、大黄素和黄芪多糖联合给药组(15只)、秋水仙碱组(15只)。

　　1.3 大鼠肝损伤模型的建立 除正常对照组外，每只大鼠首次皮下注射400mL/L CCl4橄榄油溶液2mL/kg体重，以后每周2次皮下注射400mL/L CCl4橄榄油溶液1mL/kg体重，同时给高脂饲料(79.5%单纯玉米粉加上20%猪油、0.5%胆固醇)作为唯一饮食，并以100mL/L乙醇作为饮料饲养动物[12];正常对照组大鼠同时给予相同剂量的橄榄油皮下注射。共12周。

　　1.4 药物干预 造模同时，按表1分别每日给每组大鼠相应的药物或蒸馏水灌胃1次，连续干预12周。

　　1.5 标本采集 造模12周末处死动物，为便于统计分析，各组均随机取8只用于检测。

　　1.5.1 肝组织羟脯氨酸(Hyp)含量的测定 采用水解消化法。

　　1.5.2 肝组织电镜标本的制备 于肝脏左叶相同部位留取肝组织，切成1mm×1mm×1mm大小，立即置于25mL/L的戊二醛固定液中(0.1mmol/L磷酸缓冲液、40g/L多聚甲醛)4℃固定2h以上，0.1mmol/L磷酸缓冲液浸洗30min;10g/L四氧化锇固定液(0.1mmol/L磷酸缓冲液)4℃后固定2h，0.1mmol/L磷酸缓冲液浸洗10min;乙醇梯度脱水：300mL/L乙醇10min，500mL/L乙醇10min，700mL/L乙醇10min;700mL/L乙醇醋酸双氧铀块染2h或过夜;900mL/L乙醇10min×2;1000mL/L乙醇10min×3;还氧丙烷置换10min;环氧树脂Epon812浸透、包埋，聚合后做1～2μm半超薄切片;美兰染色后光学显微镜下定位，瑞典LKBⅤ型超薄切片机做50～70nm超薄切片;醋酸铀、柠檬酸铅染色后，日本日立H600透射式电子显微镜下观察、拍照。表1 大鼠的分组和给药种类及剂量

　　1.6 统计学处理 应用SPSS11.0软件进行统计学分析。计量资料数据以±s表示，组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，多个样本均数之间的多重比较用PostHoc LSD法。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 大鼠肝组织中Hyp含量的变化 采用CCl4等复合因素造模后，各组大鼠肝组织Hyp含量明显升高，尤其是单纯造模组，与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。单用及联合应用大黄素和黄芪多糖治疗后，各治疗组大鼠肝组织Hyp含量明显降低，与单纯造模组比较差异有统计学意义(P<0.05)。黄芪多糖组和联合用药组均能明显降低大鼠肝组织Hyp含量，且效果优于秋水仙碱组(P<0.05，表2)。表2 大鼠肝组织肝匀浆中Hyp含量的变化

　　2.2 电镜观察结果

　　2.2.1 正常对照组 肝细胞结构形态基本正常，细胞核圆形，位于细胞的中央，核内染色质分布均匀，核仁居中，细胞质内细胞器丰富。粗面内质网(rough endoplasmic reticulum, RER)呈层状排列，其表面有核糖体附着;线粒体形态多为圆形或椭圆形，嵴稀疏短小;糖原颗粒分散在细胞质内。储脂细胞又称肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)位于窦周间隙(Disse间隙)，细胞核不规则，细胞质内细胞器较少，可见到电子密度较低的脂肪滴;肝窦内可见到肝巨噬细胞(kupffer cell)，表面有较多的突起，细胞形态细长，细胞质内可见溶酶体(图1A)。

　　2.2.2 单纯造模组 细胞结构不清晰，多数肝细胞胞质内出现肿胀空泡和大量的脂滴，大小不均的细胞核由于脂滴的挤压变形，部分肝细胞坏死，胞核皱缩，胞质疏松，细胞器崩解，周围见炎性细胞浸润，亦可见凋亡肝细胞。线粒体肿大，RER轻度扩张，结构不清晰。窦周间隙储脂细胞略有增多，体积增大。肝窦结构紊乱破坏，不易找到HSC，由分化程度不等的肌成纤维细胞充斥，其周围可见胶原纤维束。Kupffer细胞内溶酶体丰富，吞噬脂滴数量较多，细胞体积增大，可见到细胞分裂现象(图1B)。

　　2.2.3 大黄素组 细胞结构基本正常，肝细胞核圆形，核内染色质分布均匀，可见少量脂滴，HSC数量不多，结构基本正常。Kupffer细胞内溶酶体较多，并有吞噬的脂滴及细胞碎片(图1C)。

　　2.2.4 黄芪多糖组 细胞结构基本正常，肝细胞质内仍有少量脂滴，线粒体及RER无明显的改变，细胞间可见到胶原纤维增生。HSC数量不多。Kupffer细胞增多，细胞内吞噬的脂滴较多(图1D)。

　　2.2.5 联合用药组 肝细胞结构清晰，形态接近正常，包膜规整，细胞质内见少量脂滴，线粒体嵴排列规整，内质网增生且明显扩张。肝窦隙可见呈梭形或杆状的HSC，内有大小不等的脂肪滴，亦见极少量肌成纤维细胞，肝窦内充斥少量纤细胶原纤维束。Kupffer细胞脂滴不多(图1E)。

　　2.2.6 秋水仙碱组 肝细胞内仍有较多的脂滴，线粒体结构不清晰，嵴肿胀排列不规整，甚至崩解，内质网扩张明显。HSC体积不大，呈不规则形甚至融合，周围充斥少量胶原纤维。Kupffer细胞内溶酶体不多，脂滴不明显(图1F)。

　　3 讨 论

　　肝细胞损伤时观察肝脏超微结构变化是研究肝损伤发生机制的重要内容。我们前期的研究发现，大黄素、黄芪多糖单用和两药联合均有一定的保肝作用[35]。本研究采用大黄素、黄芪多糖单用和两药联合干预CCl4复合因素引起的肝损伤过程，检测肝组织羟脯氨酸含量，同时电镜观察其对肝脏超微结构的影响，了解其对肝损伤的保护作用。

　　电镜结果发现：单纯造模组大鼠肝细胞结构损伤明显，表现为细胞结构不清晰，细胞核由于脂滴的挤压变形，部分肝细胞坏死，胞核皱缩，胞质疏松，细胞器崩解，周围见炎性细胞浸润，亦可见凋亡肝细胞。多数肝细胞胞质内出现肿胀空泡和大量的脂滴，大小不均，也可看到窦周间隙HSC略有增多，体积增大，胞质中粗面内质网发达，胞体周围可见胶原纤维束。同时观察到线粒体肿胀变性、增生肥大。RER扩张，结构不清晰。Kupffer cell细胞内溶酶体丰富，吞噬脂滴数量较多，细胞体积增大，可见到细胞分裂现象。提示CCl4复合因素对肝脏细胞损伤的广泛性及严重性[67]。

　　在实验的整个过程中，应用大黄素、黄芪多糖分别干预，结果发现不论是单用药组还是联合用药组均表现出一定的保护肝损伤作用。线粒体及RER是细胞代谢的重要细胞器，其主要功能为细胞中制造能量及生成输出蛋白，其发达程度反映着肝细胞的功能状态;而HSC的主要功能为贮存维生素A，调节肝小叶的血流量和清除外源性有毒物质，激活的HSC可演变为成纤维细胞。因此，能够保护重要细胞器免于损伤或最大程度减轻损伤就具有一定保肝作用。本实验结果发现，大黄素组在减少脂滴形成及HSC细胞数量方面具有优势，而黄芪组有较明显保护线粒体及减少脂滴的形成作用。两药联合应用后其保护肝损伤作用明显加强，表现为在肝细胞结构基本完整，形态接近正常，细胞质内脂滴偶见，线粒体嵴排列规整，肝窦隙可见呈梭形或杆状的HSC，肝窦内充斥少量纤细胶原纤维束，Kupffer细胞脂滴不多。

　　A: normal group (TEM×20000); B: model group (TEM×20000); C: EMO group (TEM×3500); D: APS group (TEM×20000); E: combination group (TEM×3500); F: colchicine group (TEM×3500) 羟脯氨酸(Hyp)是机体胶原蛋白的主要成分之一，为胶原纤维特有的氨基酸，在正常胶原蛋白中含量约13.4%，在弹性蛋白中含量极少(约1%)，在其他蛋白中不存在[8]。慢性肝损伤导致肝纤维化发生时，由于机体大量合成胶原纤维，胶原肽链合成后，在脯氨酸羟化酶作用下，将肽链上的脯氨酸羟化形成，同时已形成的胶原又在胶原酶作用下分解，Hyp含量亦相应增加。目前直接检测肝组织中Hyp含量已成为衡量机体胶原组织代谢的重要指标[9]。从实验结果分析，单用及联合应用大黄素和黄芪多糖均能够减少大鼠肝脏Hyp含量，初步表明其具有抑制胶原纤维的合成在肝内沉积的作用。

　　本研究也进一步阐释了我们前期的实验结果，即大黄素与黄芪多糖联合应用对CCl4诱发的大鼠慢性肝损伤具有一定的降低转氨酶和抗纤维化作用。因此，大黄素及黄芪多糖两药单用或联合应用，尤其是联合应用，可能通过明显降低脂滴形成及纤维细胞形成而起到对肝损伤的保护作用。

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