二甲双胍对胰岛细胞脂毒性的保护作用

　　【摘要】 目的 探讨二甲双胍(MF)在游离脂肪酸(FFA)诱导的胰岛细胞凋亡中的作用及机制。方法 采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法观察FFA对小鼠βTc3细胞增殖的抑制作用;流式细胞术检测细胞的凋亡率;免疫细胞化学和Western blot法检测pJNK、pcjun在FFA、特异性JNK抑制剂(SP600125)阻断JNK信号转导通路情况下及MF作用下的表达。结果 FFA对体外生长的βTc3细胞具有明显的抑制作用，并可诱导细胞凋亡;MF可显著减少这一过程中的细胞凋亡。细胞免疫化学及Western blot结果显示，FFA诱导βTc3细胞凋亡伴随着pJNK和pcjun的升高而增加;用SP600125预处理βTc3细胞后，可以明显减少pJNK和pcjun的活化，而MF没有能够抑制FFA引起的pJNK活化。结论 MF可以抑制FFA介导的小鼠βTc3细胞凋亡，但不是通过JNK信号转导通路发挥作用的。

　　【关键词】 游离脂肪酸;βTc3细胞;JNK信号通路;二甲双胍;脂性凋亡

　　Effects of metformin on lipotoxicitic apoptosis in mouse

　　β Tc3 cells induced by free fatty acidsWANG Yuhuan, DA Ting, YAN Lili, ZHENG Huadong, WU Juanjuan, ZHANG Jing

　　(Department of Endocrinology, the Second Affiliated Hospital,

　　Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710004, China)ABSTRACT: Objective To investigate the effects of metformin on apoptosis in mouse β Tc3 cells induced by free fatty acids (FFA) and the underlying mechanism. Methods MTT assay was used to observe the inhibitory actions of FFA on the proliferation of β Tc3 cells. The apoptosis rate of the cells was detected by flow cytometry. The expressions of pJNK and pcjun were detected by immunocytochemistry and Western blot. Results The proliferation of β Tc3 cells was remarkably inhibited by FFA in vitro, and significant apoptosis was present. Metformin could inhibit the apoptosis significantly. Immunocytochemistry and Western blot results showed FFA induced activation of pJNK, pcjun. As a JNK inhibitor, SP600125 partly suppressed FFAinduced activation of pJNK and pcjun; however, metformin did not suppress it. Conclusion Metformin could inhibit the apoptosis of mouse β Tc3 cells stimulated by free fatty acids, but the JNK signaling pathway is not involved in the mechanism.

　　KEY WORDS: free fatty acid; β Tc3 cell; JNK signaling pathway; metformin; lipoapoptosis

　　进入胰岛β细胞的游离脂肪酸(free fatty acid, FFA)超过了其对脂肪酸氧化的能力，导致过多的脂质在细胞内堆积，使得β细胞发生功能障碍及凋亡增加。这一过程称为胰岛β细胞脂毒性学说，是近年来对胰岛素抵抗、2型糖尿病发病机制的研究热点。研究表明，长期暴露于高FFA可引起人和鼠胰岛β细胞脂质过载，细胞增生下调，凋亡增加[12]。双胍类(biguanides)降糖药是目前用于治疗2型糖尿病的常用药物之一，其主要作用于胰外组织，促进周围组织中糖的无氧酵解，增加肌肉等组织对葡萄糖的摄取及利用，抑制或延缓葡萄糖在胃肠道的吸收，促进胰岛素与胰岛素受体的结合，提高胰岛素敏感性。临床上应用最广泛的是二甲双胍(metformin, MF)。近年来研究指出，在2型糖尿病中MF改善胰岛素敏感性与循环中FFA降低相关[34]，它可改善脂毒性对胰岛细胞的损害[5]。有报道表明，JNK信号通路参与了β细胞凋亡、胰岛素基因表达障碍和胰岛素抵抗的发生[6]。JNK抑制剂的应用可显著减少FFA介导的胰岛β细胞凋亡[7]。在本研究中，我们通过FFA诱导胰岛β细胞凋亡，观察MF干预下胰岛β细胞凋亡率及JNK活性的变化，初步探讨MF对高FFA环境下的胰岛β细胞有无保护作用及其作用机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 小鼠βTc3细胞由唐都医院内分泌科实验室馈赠;棕榈酸(PA)、特异性JNK抑制剂SP600125及实验用MF均购自Sigma公司;RPMI 1640培养基为GIBCO公司产品。胎牛血清为Hyclone公司产品;Annexin VFITC细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司;鼠抗磷酸化JNK(pJNK)、磷酸化cjun(pcjun)、βactin抗体为Santa Cruz公司产品;二抗SP免疫组化染色试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司;二抗HRP标记的山羊抗小鼠IgG、DAB显色试剂盒均购自北京中衫金桥生物技术有限公司;RIPA细胞裂解液购自北京索莱宝生物科技有限公司;BCA蛋白分析试剂盒及ECL试剂盒购自美国Pierce公司;丙烯酰胺、双丙烯酰胺、Tris、TEMED、十二烷基磺酸钠(SDS)、过硫酸铵(APS)、甘油、溴酚兰、甘氨酸、二硫苏糖醇(DTT)等均为Amresco产品;硝酸纤维素(NC)膜为Amersham公司产品。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养 小鼠βTc3细胞用含100mL/L胎牛血清的RPMI 1640完全培养基(青霉素100u/mL、链霉素100μg/mL)，在饱和湿度、37℃、50mL/L CO2孵箱中培养传代。细胞每两天换液1次，4～5d以2.5g/L的胰蛋白酶消化传代1次。

　　1.2.2 实验分组与处理 选择生长良好的细胞用于实验。实验分4组，A组(对照组);B组(PA组)：0.5mmol/L的PA干预;C组(PA+SP600125组)：SP600125(20μmol/L)预先孵育1h，再以0.5mmol/L的PA干预;D组(PA+MF组)：MF(0.5mmol/L)及0.5mmol/L的PA共同孵育。

　　1.2.3 MTT法检测细胞增殖活力 取对数生长期细胞制成单细胞悬液，接种于96孔细胞培养板上，每孔200μL培养液。按上述分组处理细胞后，分别于12、24、48h取出，每孔加入20μL(5g/L)MTT，继续培养4h，弃去培养液。每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150μL，震荡10min后，于490nm波长测A值，计算PA对各组细胞的生长抑制率。抑制率(%)=(1-A加药组/A对照组)×100%。

　　1.2.4 细胞凋亡的镜下观察 在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸(PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的PS由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种分子质量为35～36ku的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与PS有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的PS与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此，Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。碘化丙啶(PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期和坏死的细胞，PI能够通过细胞膜而使胞核红染，因此将Annexin V和PI匹配使用，就可将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

　　按照细胞凋亡检测试剂盒中的方法，将细胞用胰酶消化收集，接种于预先放好盖玻片的6孔板中，待细胞生长至对数生长期时药物干预，然后开始如下处理。用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞2遍(2000r/min离心5min)，在500μL的结合缓冲液中加入5μL Annexin VFITC及PI混匀，将此溶液滴加于盖玻片表面，使之均匀覆盖，避光、室温反应5min。将盖玻片倒置于载玻片上，于荧光显微镜下观察荧光染色信号。

　　1.2.5 细胞凋亡的定量分析 将各组细胞用胰酶消化收集，PBS液洗涤细胞2遍(2000r/min离心5min)，收集细胞，加入500μL结合缓冲液悬浮细胞，再加入5μL Annexin VFITC及5μL PI混匀，室温、避光反应15min。用流式细胞仪定量分析，计算Annexin VFITC及PI双染阳性细胞百分含量。

　　1.2.6 免疫细胞化学方法检测pJNK、pcjun蛋白的表达 将细胞用胰酶消化收集，接种于预先放好盖玻片的6孔板中，待细胞生长至对数生长期时药物干预，24h后取出，4℃ PBS液洗2次，40g/L多聚甲醛溶液固定20min，弃去固定液，PBS洗2次，将盖玻片用中性树胶粘于载玻片上，烤干。PBS浸泡5min，30mL/L H2O2去离子水孵育15min，以消除内源性过氧化物酶活性。滴加正常山羊血清工作液封闭15min，倾去，滴加1∶200的鼠抗pJNK和鼠抗pcjun，4℃过夜，滴加生物素化二抗工作液孵育15min，PBS冲洗。滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液孵育15min，PBS冲洗后DAB显色，复染、脱水、透明、封片。以胞质出现棕褐色颗粒为阳性反应，阴性对照除细胞核染成蓝色外，胞质内无棕褐色反应物。采用图像信号采集系统对蛋白的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野(×400)，测定每个视野下阳性反应的平均吸光度。

　　1.2.7 Western blot分析pJNK、pcjun水平 将干预好的细胞去除培养液，4℃ PBS液洗2次，加入适量细胞裂解液及PMSF，使裂解液和细胞充分接触。冰上裂解20min后，4℃、12000r/min离心5min，取上清，BCA法蛋白定量，调整每孔上样量为30μg。100g/L SDSPAGE分离蛋白质，之后转移至NC膜，室温下50g/L脱脂奶粉封闭液封闭2h。1∶300的鼠抗pJNK、抗pcjun抗体4℃过夜孵育。之后，TBST液洗膜3次，每次10min，然后1∶2000的HRP标记的山羊抗鼠抗体室温下孵育2h。TBST洗膜后，发光，照相。条带采用Bandscan分析软件测定灰度值，进行定量分析。

　　1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件进行统计学处理。计量结果均以 ±s表示，细胞增殖抑制率的比较采用重复测量数据的方差分析，组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD法。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 PA对胰岛细胞增殖活性的影响 MTT法检测细胞增殖抑制率，结果显示，PA干预12、24、48h后，细胞增殖抑制率呈时间依赖性升高，分别为(18.34±0.92)%、(49.7±1.83)%、(56.2±1.98)%，同对照组的(1.21±0.11)%比较差异均有统计学意义(P<0.05)。但是，PA处理48h后，镜下可见多量漂浮细胞，胞膜皱缩，细胞固缩成圆形。

　　2.2 胰岛细胞的凋亡情况 荧光显微镜下可见，随着PA作用时间的延长，早期及晚期凋亡的细胞逐渐增多。PA干预24h后，早期凋亡细胞占大多数，仅可见少量红染的晚期凋亡及坏死细胞;干预48h后早期凋亡细胞较PA干预24h明显增多，除此之外还可见较多量核红染的坏死细胞。因此为了排除坏死细胞对实验结果的影响，我们采用24h作为干预时间，来探讨PA对各指标的影响。

　　2.3 各组胰岛细胞凋亡率的比较 流式细胞仪分析显示，细胞经PA作用24h后，A、B、C、D组胰岛细胞的凋亡率分别为(0.21±0.11)%、(39.87±2.23)%、(16.15±1.28)%、(27.49±1.88)%。B、C、D组均显著高于A组(P<0.05)，C、D组又显著低于B组(P<0.05)，C、D组之间也有统计学差异(P<0.05，图1)。

　　图1 流式细胞仪分析各组胰岛细胞的凋亡率

　　Fig.1 Flow cytometric analysis of apoptosis rate in each group2.4 免疫细胞化学结果 pJNK、pcjun两种蛋白的免疫染色结果显示，A组细胞未见棕褐色颗粒，B、C、D组均可见胞质中均匀分布的棕褐色颗粒(图2)。图像分析结果显示，A、B、C、D组pJNK蛋白的平均吸光度值分别为0.0325±0.0016、0.2247±0.0123、0.1786±0.0137，0.2737±0.0104。可见B、C、D组平均吸光度值显著高于A组(P<0.05)，C组显著低于B组(P<0.05)，而D、B组之间无显著差异(P>0.05)。A、B、C、D组pcjun蛋白的平均吸光度值分别为0.0397±0.0015、0.2469±0.0074、0.2065±0.0053，0.2537±0.0104。B、C、D组平均吸光度值显著高于A组(P<0.05)，C组显著低于B组(P<0.05)，而D、B组之间无显著性差异(P>0.05)。因此，B、C、D组两种蛋白的表达含量均高于对照组，B组高于C组，而D、B组之间表达无显著性差异。

　　2.5 Western Blot结果 检测的目的条带如图3所示。采用Bandscan分析软件测定灰度值，并用其相对应的βactin 条带灰度值进行校正，计算相对含量。与A组相比，B、C、D组的pJNK、pcjun相对含量均明显增多，C组较B组减少明显(P<0.05)，而D组与B组之间则无显著性差异(P>0.05，图4)。

　　3 讨 论

　　胰岛素抵抗在2型糖尿病的发生、发展中起着极为重要的作用。二甲双胍作为一种胰岛素增敏剂，主要改善肝脏、肌肉及脂肪组织对胰岛素的敏感性,增加肌肉、脂肪组织对葡萄糖的利用率,达到降血糖的目的。有研究证实，MF能使慢性游离脂肪酸及高糖所致的胰岛β细胞功能有所改善，使高糖介导的胰岛素释放功能障碍恢复正常，提示MF对β细胞的糖脂毒性损害具有一定程度的逆转作用。另外发现，MF除了能够改善全身胰岛素抵抗外，还能增加β细胞胰岛素受体酪氨酸蛋白激酶(IRcTPK)的活性改善胰岛β细胞的胰岛素抵抗，从而对β细胞发挥保护作用[8]。

　　传统的观念认为MF降糖作用主要在于抑制肝糖异生，减少肝糖的产生和输出，同时增加外周组织对胰岛素的敏感性，降低极低密度脂蛋白(VLDL)的产生，对胰岛β细胞无直接作用。因此，很多研究报道集中于MF改善胰岛素敏感性的作用方面，而对胰岛β细胞的直接作用及机制的研究较少。

　　BENJAMIN[9]等发现，长时间暴露于含MF的细胞培养液中的MIN6细胞会通过激活AMPK途径而发生凋亡，尤其以48h及以上时间显著。另有研究发现，在多种组织细胞中，MF均能够通过增加细胞内AMP/ATP的比值和另一种直接的信号途径来激活AMPK[1011]。它还能够通过激活人类预先筛选的脐静脉内皮细胞(HUVEC)的AMPK，减少PA诱导的血管内皮细胞损伤[12]。对自发性2型糖尿病大鼠给予MF灌胃，其胰岛β细胞凋亡指数显著低于模型组，从而发挥了MF对胰岛β细胞的保护作用[13]。还有研究发现，MF通过GLP1途径抑制二酰基肽酶活性，减少胰岛β细胞凋亡[14]。BENJAMIN[9]等的发现与后面的研究报道不一致，可能是因为采用实验对象不同，药物作用时间不同等造成。可见，MF对细胞凋亡的作用还存有争议。本实验初步探讨了MF短期作用下对βTc3细胞脂性凋亡的影响，认为它对脂性凋亡具有抑制作用。

　　参与细胞凋亡的途径多种多样，目前有关胰岛β细胞脂性凋亡的研究涉及9种以上途径，其中包括细胞内甘油三酯(TG)含量和脂毒性、caspase途径、神经酰胺途径、Bcl2途径、胰腺十二指肠同源盒(PDX1)、12脂氧合酶(12LO)、G蛋白偶联受体、胰岛素信号转导通路障碍、PPAR途径、内质网应激、氧化应激和炎症反应等。近年来发现JNK参与氧化应激诱导的细胞凋亡、Fas及TNF诱导的细胞凋亡以及化疗药物诱导的细胞凋亡[15]等。但它对胰岛β细胞脂性凋亡的影响尚罕见报道。

　　本实验采用FFA成功诱导了胰岛细胞凋亡，表明高FFA水平是促进胰岛β细胞凋亡的重要原因之一。当胰岛细胞在高FFA水平条件下培养时出现了较高水平的pJNK的表达，激活了JNK的活性，其下游蛋白pcjun也被激活，与此同时胰岛细胞的凋亡也显著增加，这说明JNK信号通路参与了FFA诱导的胰岛β细胞凋亡。当用SP600125抑制了JNK通路后细胞凋亡率降低，进一步证实JNK参与了胰岛细胞凋亡的病理过程。而应用MF后，细胞凋亡率也显著降低，但pJNK、pcjun的表达与PA组相比无显著性差异，也就是说，MF没有抑制PA引起的JNK的激活，它减少胰岛β细胞凋亡可能没有通过JNK信号通路。本实验结果表明，MF可以减少FFA诱导的胰岛β细胞凋亡，但暂未发现与JNK信号通路有关，其具体机制及JNK信号通路与其它通路的联系及相互作用还需进一步研究。

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