盐负荷对培养人内皮细胞基因表达谱的影响

　　【摘要】 目的 利用基因芯片技术检出与培养基盐浓度直接相关的人内皮细胞差异表达基因。方法 以培养人脐静脉内皮细胞为研究对象，用10mmol/L NaCl干预培养的内皮细胞12h，用8000点表达谱基因芯片检测出干预组和对照组的内皮细胞差异表达基因。结果 8000点基因芯片检测结果发现10mmol/L NaCl干预组内皮细胞D63424、HUMTOPII、HUMMTTRPR、HSRAB7、HUMDNAJHOM(GenBank ID)等24个基因的表达较对照组显著上调，而HUMHHR6A、AF116272、AF131808、I78456、HSA011712等27个基因表达显著下调。结论 发现了与盐负荷直接相关的培养人脐静脉内皮细胞差异表达基因谱的改变，为进一步进行血压盐敏感性标志的筛选提供依据。

　　【关键词】 盐负荷;内皮细胞;基因表达;高血压;盐敏感性

　　Effect of salt loading on gene expression profile of endothelial cellsZHU Danjun, LIU Huasheng, WANG Yongxing, XUE Xiaolin, LIU Zhiquan

　　(Department of Cardiovascular Medicine, the First Affiliated Hospital, Medical School of

　　Xian Jiaotong University; the Key Laboratory of Environment and Gene

　　Related to Diseases, Ministry of Education, Xian 710061, China) ABSTRACT: Objective To detect the differential expression genes of endothelial cells which have direct relation with salt concentration by gene expression profiling chip. Methods After human umbilical vein endothelial cells were treated with 10mmol/L NaCl for 12h, we detected the differential expression genes in the intervention group and the control group by gene expression microarray chip of 8000 dots. Results Results of 8000 dots gene expression chip showed that compared with that in the control group, expression of 24 genes in the endothelial cells treated with 10mmol/L NaCl was upregulated, the GenBank ID of which was D63424, HUMTOPII, HUMMTTRPR, HSRAB7 and HUMDNAJHOM, and that expression of 27 genes, including HUMHHR6A, AF116272, AF131808 and I78456, HSA011712, was downregulated. Conclusion This experiment was the first to discover the differential gene expression profile in cultured human umbilical vein endothelial cells in direct relation with salt loading, which may serve as the basis for further screening of genetic marker of salt sensitivity.

　　KEY WORDS: salt loading; endothelial cell; gene expression; hypertension; salt sensitivity

　　盐是高血压最重要的环境因素之一，但个体对盐负荷或限盐却呈现不同的血压反应，存在盐敏感性问题。血压盐敏感性是高血压的一个中间遗传表现型，盐敏感性标志筛选研究是探索盐与高血压关系的核心所在，但目前尚无一理想的血压盐敏感性标志[12]。血管内皮在高血压发生、发展中起关键作用，多种高血压动物模型，包括自发性高血大鼠、DOCA盐高血压大鼠和Dahl盐敏感性高血压大鼠均存在内皮功能异常。临床研究表明，高盐摄入和/或血压盐敏感性均与内皮功能障碍相关联[3]。本研究以培养人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)为研究对象，利用差异表达基因芯片检测盐负荷对内皮细胞基因表达谱的影响，发现相关的内皮细胞差异表达基因，将为进一步的血压盐敏感性标志筛选研究提供直接依据。

　　1 对象与方法

　　1.1 研究对象 人脐静脉内皮细胞株ECV304，购自中国科学院上海细胞所。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 血管内皮细胞培养 血管内皮细胞用含100mL/L胎牛血清的DMEM培养基(Gibco公司)培养内皮细胞密度达80%后，随机分为对照组和干预组，干预组培养基加入NaCl使其浓度提高10mmol/L，两组细胞随后继续培养12h，收获细胞备用，每组细胞数目约108。

　　1.2.2 RNA提取 将收获细胞按107/1.5mL Eppendorf管分开;每管加入Trizol试剂1mL，混匀，置室温5min;加氯仿0.2mL，摇振15s，置室温5min;4℃离心，10000g×5min;仔细吸取上层水相，移至另一Eppendorf管中;加0.5mL异丙醇，置室温10min;4℃离心，10000g×10min;加750mL/L乙醇1mL，摇振，充分洗涤沉淀，4℃离心，5000g×5min;弃上清，真空干燥后，沉淀重悬于无RNase水中，-70℃保存备基因芯片检测。

　　1.2.3 表达谱芯片的制备 芯片所用的8000条基因cDNA克隆由上海博道基因公司提供(其中包括受体类、信号传递类、离子通道类、细胞周期类、肿瘤类等)，用通用引物进行PCR扩增，PCR产物长度为1000～3000bp。PCR反应及产物纯化用标准方法进行，通过琼脂糖凝胶电泳监控PCR质量。靶基因溶解于3×SSC溶液中，用Cartesian公司的点样仪及TeleChem公司的硅烷化玻片进行点样。点样后玻璃片经水合(2h)、室温干燥(0.5h)、UV交联(能量值设定为65mJ/cm)，再分别用2mL/L SDS、水及2mL/L硼氢化钠溶液处理10min，晾干备用。

　　1.2.4 探针制备 用Gibco公司的Trizol试剂抽提培养的血管内皮细胞总RNA，具体方法是： 细胞用冰冷PBS(pH 7.2)洗涤2次，加Trizol裂解细胞;氯仿抽提1次;异丙醇沉淀RNA;750mL/L乙醇洗2次，空气干燥，Nets缓冲液溶解，紫外和电泳分析。用Oligotex mRNA Midi Kit(Quagen公司)纯化mRNA，参照SCHENA等的方法逆转录标记cDNA探针并纯化。用Cy3dUTP标记对照组细胞的mRNA，用Cy5dUTP标记NaCl干预组细胞的mRNA。乙醇沉淀后溶解在20μL 5×SSC+2mL/L SDS杂交液中。

　　1.2.5 杂交及洗涤 将基因芯片和杂交探针分别在95℃水浴中变性5min，将探针加在基因芯片上，用盖玻片封片，置于60℃杂交16h。然后揭开盖玻片，分别用2×SSC+2mL/L SDS，1mL/L×SSC+2mL/L SDS，1mL/L×SSC洗涤10min，室温晾干。

　　1.3 检测与分析 用General Scanning公司的ScanArray3000扫描芯片，用ImaGene3.0软件分析Cy3和Cy5两种荧光信号的强度和比值。用40个管家基因进行Cy5和Cy3的均衡。用以下2个条件为判定基因差异表达的标准：①Cy5和Cy3信号的比值的自然对数绝对值>0.69(基因的表达差异在2倍以上)。②Cy3和Cy5信号值其中之一必须达600以上。

　　2 结 果

　　2.1 基因芯片的质量标准控制 H80d基因表达谱芯片的质量控制标准是：有40个管家基因表达必须阳性，32个植物基因(阴性对照)表达必须阴性，42个点样液(空白对照)也必须阴性。本实验结果符合上述条件，说明实验无污染而且检测体系正常。

　　2.2 基因芯片的2次重复试验结果

　　2.2.1 基因芯片杂交信号散点图 见图1。基因芯片杂交所用的双探针分别以NaCl干预组和对照组内皮细胞的mRNA为模板，前者标以Cy5荧光素，后者标以Cy3荧光素。2次重复试验结果显示约0.65%(52/8000)的已知基因具有2倍以上表达水平的差异。每一个数据点代表芯片上一个基因点的杂交信号，Y轴为此Cy5荧光强度值(=前景值-背景值)，X轴为Cy3的荧光强度值(=前景值-背景值)。45°角直线上的点的Cy5/ Cy3的比率为1，表示无表达差异;远离45°角直线的点为差异表达基因——数据点若为红色，则代表Y值与X值的比值在0.5至2.0之间，基本属非差异表达;数据点若为黄色，则代表Y值与X值的比值在0.5到2.0范围之外(很可能是有表达差异的数据)。

　　2.2.2 基因芯片杂交扫描图 见图2、图3。扫描图像分别显示1次Cy3和Cy5标记的探针与芯片杂交的结果，其中白色点为超高表达而信号达饱和状态，其他点由红色向蓝黑色表示信号由强至弱。

　　2.2.3 基因芯片双色荧光标记叠加图 见图4。将Cy3和Cy5扫描图像完全重叠后，并赋以伪色成为双探针杂交的结果图。由于Cy3荧光信号和Cy5荧光信号分别以绿色和红色表示，因此，对于某一点的两种叠加荧光信号，如果Cy3信号较强，该点多显绿色(呈下调趋势);如果Cy5信号较强，该点多显红色(呈上调趋势) ;如果强度相似，即显示黄色。

　　2.2.4 基因芯片数据分析结果 见表1、表2。表1 10mmol/L NaCl干预组内皮细胞12h的差异表达下调基因表2 10mmol/L NaCl干预组内皮细胞12h的差异表达上调基因

　　3 讨 论

　　本研究结果显示：以10mmol/L之氯化钠干预HUVECs 12h，2次重复基因芯片检测结果显示其基因表达谱发生改变，其中表达显著上调的基因包括D63424、HUMTOPII、HUMMTTRPR、HSRAB7、

　　HUMDNAJHOM(GenBank ID)等24个基因，而HUMHHR6A、AF116272、AF131808、I78456、HSA011712等27个基因的表达显著下调(表1、表2)。

　　血管内皮在高血压发生、发展中起关键作用。多种高血压动物模型，包括自发性高血压大鼠(SHR)、DOCA盐高血压大鼠和Dahl盐敏感性高血压大鼠均存在内皮功能障碍。乙酰胆碱对SHR的血管舒张作用显著减弱，血浆L精氨酸浓度、NO合成酶(NOS)基因表达水平显著低于血压正常对照组大鼠，给血压正常大鼠应用NOS抑制剂已造出新的高血压模型。高盐摄入导致Dahl盐敏感高血压大鼠肠系膜血管明显增生肥厚，抑制其对NO的反应性。LIU等[4]发现高盐饮食严重损害SpragueDawley大鼠的内皮及其受体介导的血管扩张作用。临床研究显示，原发性高血压患者亦存在内皮功能障碍，而盐敏感性高血压患者内皮功能障碍较盐不敏感高血压患者更甚，长期高盐摄入可加重盐敏感性高血压患者相关的心、脑、肾等靶器官损害[56]。研究表明，多种因素均可显著改变内皮细胞的基因表达谱。COOMBS[7]等用肺炎衣原体感染内皮细胞24h，即见显著的内皮细胞基因表达谱改变，其中编码白介素1、白介素8、生长因子类基因的mRNA表达上调近20%，且此种上调在感染后2h就开始出现。尼古丁同样可引起内皮细胞基因表达谱改变，其中包括众多与信息传递及转录调节相关的基因。此外，剪切应力、支架植入、肿瘤坏死因子α等均可显著改变内皮细胞基因表达谱。本研究首次以盐干预培养人脐静脉内皮细胞，用8000点基团芯片检测其基因表达谱的变化，发现众多差异表达基因，其中涉及与血压盐敏感性和发生、发展密切相关的基因，包括离子通道和运输蛋白、细胞受体、细胞信号和传递蛋白、代谢类等多类基因，如本实验中发现的糖原合成酶激酶基因、热休克蛋白、表皮生长因子受体、氯通道蛋白、细胞色素C氧化酶、G蛋白藕联受体等多个差异表达基因，上述基因表达改变与血压盐敏感者的能量代谢异常、应激血压反应异常及离子转运障碍等相吻合，可作为后续的血压盐敏感性标志的筛选研究的基础。

　　基因表达芯片，又称基因表达微阵列(gene expression microarray)，可以将已克隆到的数千个基因特异的探针或其cDNA片段固定在一块DNA芯片上，对来源于不同刺激(包括不同诱导、不同治疗手段)、不同个体(正常人与患者)、不同组织、不同细胞周期、不同发育阶段、不同分化阶段、不同病变下的细胞内的mRNA或逆转录后产生的cDNA进行检测，从而对这些基因表达的刺激特异性、个体特异性、组织特异性、发育阶段特异性、分化阶段特异性、病变特异性进行综合的分析和判断，迅速将某个或几个基因与疾病联系起来，极大地加快这些基因功能的确立，同时可进一步研究基因与基因间相互作用的关系，具有高效性。基因表达芯片研究基因表达与传统的Northern杂交相比有许多重要的优点：①检测系统的微型化，对样品的需要量非常小;②由于能同时研究上千个基因的表达变化，研究效率明显提高;③能更多地揭示基因之间表达变化的相互关系，从而研究基因与基因之间内在作用关系;④检测基因表达变化的灵敏度高，可检测丰度相差几个数量级的表达情况。因而具有极大的应用价值[8]。

　　血压盐敏感性标志的筛选研究是探索盐与高血压关系的核心所在，本实验发现了与盐负荷直接相关的培养人脐静脉内皮细胞差异表达基因，此初步结果为后续血压盐敏感性标志的筛选研究提供了依据。

　　【参考文献】

　　[1]侯嵘，刘治全，孙超峰，等. 盐敏感者细胞膜骨架蛋白Adducin α亚单位基因变异研究 [J].中华心血管病杂志, 2000, 28(5):389390.

　　[2]FANG Y, MU JJ, HE LC, et al. Salt loading on plasma asymmetrical dimethylarginine and the protective role of potassium supplement in normotensive saltsensitive Asians [J]. Hypertension, 2006, 48:724729.

　　[3]FUJIWARA N, OSANAI T, KAMADA T, et al. Study on the relationship between plasma nitrite and nitrate level and salt sensitivity in human hypertension [J]. Circulation, 2000, 101(5):856861.

　　[4]LIU Y, RUSCH NJ, LOMBARD JH, et al. Loss of endothelium and receptormediated dilation in pial arterioles of rats fed a shortterm high salt diet [J]. Hypertension, 1999, 33(2):686695.

　　[5]MORIMOTO A, UZU T, FUJII T, et al. Sodium sensitivity and cardiovascular events in patients with essential hypertension [J]. Lancet, 1997, 350(13):17341737.

　　[6]WEINBERGER MH, FINBERG NS, FINEGERG SE, et al. Salt sensitivity, pulse pressure, and death in normal and hypertensive humans [J]. Hypertension, 2001, 37[part 2]:429432.

　　[7]COOMBES BK, MAHONY JB. cDNA array analysis of altered gene expression in human endothelial cells in response to Chlamydia Pneumoniae infection [J]. Infect Immun, 2001, 69(3):14201427.

　　[8]COWELL JK, HAWTHORN L. The application of microarray technology to the analysis of the cancer genome [J]. Curr Mol Med, 2007, 7(1):103120.