表达HCV coreAnt的重组慢病毒的构建

　　【摘要】 目的 构建表达HCV 核心区的重组慢病毒，以探讨HCV感染后该病毒核心蛋白对肝脏干细胞转分化的影响。方法 利用PCR体系延伸互为模板的引物，通过T载体克隆法获得HCV coreAnt基因克隆，酶切后连入pLenti6/V5DTOPO质粒，得到pLenti6/V5DHCV coreAnt，连同pLP/VSVG、pLP1和pLP2四质粒共转染293ET细胞,获得了表达HCV coreAnt重组慢病毒。收集病毒上清，大量扩增，用免疫组化法检测目的基因在Hela细胞的表达。用类似的方法构建了表达EGFP的重组慢病毒并测定其滴度。结果 克隆出HCV coreAnt基因，经酶切及测序证实结果正确;使用表达HCV coreAnt重组慢病毒感染Hela细胞，免疫组化实验证实胞浆有HCV core表达。使用表达EGFP的重组慢病毒感染3T3细胞见到绿色荧光,说明构建慢病毒载体有效。结论 通过分子克隆体外重组技术成功制备了表达HCV core的重组慢病毒，为进一步研究丙肝病毒致癌机制奠定了基础。

　　【关键词】 丙型肝炎病毒核心蛋白;重组慢病毒;分子克隆

　　Construction of recombinant lentiviral vector expressing HCV coreAntMA Lieting, LI Yan, WANG Yawen

　　(Department of Clinical Laboratory, the First Affiliated Hospital,

　　Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China)ABSTRACT: Objective To construct a recombinant lentiviral vector for HCV coreAnt and then study its effect on the transdifferentiation of hepatic stem cells. Methods The HCV coreAnt was obtained by PCR of two primers template with each other and Tvector cloning method, and then subcloned to pLenti6/V5DTOPO. The restriction endonuclease and T4 DNA ligase were used to construct the vector. pLenti6/V5DHCV coreAnt and the ViraPowerTM PackagingMix (containing three packaging plasmids pLP1, pLP2 and pLP/VSVG) were cotransfected into 293ET cells to produce replication in competent lentivirus after transfection. The viral supernatant on 293T cells was collected. The expression of the lentiviral vector containing HCV coreAnt in Hela cells was measured by immunohistochemistry. Then we constructed the lentiviral vector containing green flurosecent protein by the similar method, and the titers were determined. Results HCV coreAnt was identified and analyzed by restriction enzyme digestion and sequencing, respectively. The expression of the recombinant lentiviral vector plasmid containing HCV coreAnt in Hela cells was confirmed by immunohistochemistry. The 3T3 cells transfected the lentiviral vector containing green flurosecent protein were found to show strong expression of GFP, which confirmed that the fourplasmid system of the lentiviral vector was successfully constructed. Conclusion The recombinant lentiviral vector expressing HCV coreAnt was successfully constructed by molecular cloning and recombination techniques in vitro, which will be beneficial to guiding further study on gene therapy of cancer.

　　KEY WORDS: HCV core protein; recombinant lentiviral vector; molecular cloning

　　丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)感染大部分转变为持续感染，继而发展为肝硬化和肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)。许多研究表明HCV的核心蛋白具有致癌潜能，且与HCC的发生发展密切相关。本试验通过构建可以表达HCV coreAnt融合蛋白的真核表达载体，试图为进一步研究丙肝病毒产物核心蛋白对肝脏干细胞的转分化作用奠定基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 克隆载体pGEMTEasy质粒(50ng/μL)，购自Promega公司。限制性内切酶BamHⅠ、HimdⅢ、XhoⅠ、Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶购自华美生物工程公司。一抗为小鼠抗HCV核心蛋白单克隆抗体，购自北京奥博森公司，HRP羊抗小鼠抗体为北京中杉公司提供。pTE28质粒、pGEM TAnt载体、pEGMHCV core cDNA克隆质粒、病毒穿梭质粒pLenti6/V5DTOPO、pLP/VSVG、pLP1、pLP2、大肠杆菌DH5α及293细胞系，由西安华广生物工程公司提供。

　　1.2 方法

　　1.2.1 构建pGEM THCV coreAnt载体 采用已经构建的HCV core cDNA克隆质粒为模板，使用PCR技术删除终止子，通过T载体克隆法构建pGEMTHCV core cDNA克隆质粒。上游引物：5′GGGATCC ATG AGC ACG AAT CCTAA3′，下游引物：5′GAAGCTT TCA CAC TTG GTA GGC CGA AG3′。PCR反应体系：10×Taq DNA聚合酶Buffer 10μL，dNTP(2.5mmol/μL)及上、下游引物各1μL，Taq DNA聚合酶(2.5u/μL)1μL，消毒去离子水将总体积加至100μL。PCR条件为：94℃变性60s，42℃退火60s，72℃延伸90s，30个循环后，再72℃延伸5min。经筛选阳性克隆、酶切鉴定及测序后，通过常规分子生物学亚克隆方法，利用已有的pGEM TAnt载体，连接Ant和HCV core cDNA在同一开放阅读框架(open reading fragment，ORF)，构建pGEM THCV coreAnt载体。

　　1.2.2 pTE28 HCV coreAnt载体构建 碱裂解法大量制备重组质粒pGEM THCV coreAnt，用限制性内切酶XhoⅠ彻底消化后再用BamHⅠ消化，切取HCV coreAnt用T4DNA连接酶连入带有相同末端的已线性化pTE28表达载体，建立表达HCV core和果蝇穿膜肽Ant的融合蛋白表达克隆。用连接反应产物转化制备好的感受态细菌E.coli DH5α菌株，随机挑选单个菌落，接种于含有氨苄西林的LB培养基内，37℃增殖培养后，碱裂解法小量提取质粒。用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ联合酶切，筛选出重组质粒pTE28 HCV coreAnt。

　　1.2.3 pLenti6/V5DHCV coreAnt的构建 XhoⅠ和BamHⅠ联合酶切慢病毒穿梭质粒pLenti6/V5D

　　TOPO和pTE28 HCV coreAnt，低熔点凝胶回收HCV coreAnt和线性化的pLenti6/V5DTOPO，T4DNA连接酶连接，转化DH5ct感受态细菌，挑选转化的菌落，提取质粒，XhoⅠ和BamHⅠ双酶切筛选并鉴定阳性克隆。

　　1.2.4 重组慢病毒的包装 采用磷酸钙沉淀法。pLenti6/V5DHCVcoreAnt同包装质粒pLP1、pLP2和包膜质粒pLP/VSVG四质粒共转染293ET细胞,获得了表达HCV coreAnt重组慢病毒。转染10d后，质粒在细胞内同源重组构建出活重组慢病毒，毒斑出现。反复冻融含病毒栓子的培养基，提取病毒，收集病毒上清。

　　1.2.5 重组蛋白的免疫细胞化学检测 使用表达HCV coreAnt重组慢病毒感染Hela细胞，将细胞接种于铺有盖玻片的6孔板，培养24～48h后，取出盖玻片，冷丙酮固定20min。30mL/L H2O2消除细胞内源性过氧化物酶活性。一抗为小鼠抗HCV核心蛋白单克隆抗体，二抗为HRP羊抗小鼠抗体。DAB显色，苏木素复染，梯度乙醇脱水，中性树胶封片，光学显微镜下观察并拍照。

　　1.2.6 构建并鉴定表达EGFP的重组慢病毒及滴度测定 用类似的方法构建了表达增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)的重组慢病毒，感染NIH3T3细胞，荧光显微镜下观察。流式细胞仪测定重组慢病毒的功能滴度，间接推测表达HCV coreAnt重组慢病毒的病毒滴度。

　　2 结 果

　　2.1 PCR产物克隆及测序结果 pGEMTHCV coreAnt cDNA克隆的酶切物理图谱及测序结果证实，我们成功地建立了果蝇穿膜肽Ant cDNA克隆和删除了终止子的HCV core cDNA克隆。

　　2.2 pTE28 HCV coreAnt的酶切鉴定 亚克隆后建立的重组质粒pTE28/HCV coreAnt经限制性内切酶酶切后,琼脂糖凝胶电泳结果显示酶切片段大小和设计预计值一致(图1)。序列测定结果表明HCV core cDNA和穿膜肽Ant cDNA 处于同一ORF，表明成功构建了表达HCV coreAnt融合蛋白的pTE28原核表达载体。

　　2.3 表达HCV core 的慢病毒载体的鉴定 重组质粒经限制性内切酶酶切后琼脂糖凝胶电泳，结果显示酶切片段大小和设计预计值一致(图2)。

　　2.4 免疫组化实验证实胞浆有HCV core表达 经免疫细胞化学方法检测，在转染有HCV core的Hela细胞胞浆中，有棕黄色的阳性信号，且细胞形态发生明显变化;而阴性对照细胞中未出现棕黄色信号(图3)。说明所转染的细胞中有蛋白的表达。

　　2.5 EGFP重组慢病毒感染3T3细胞后的表达及病毒滴度 用磷酸钙沉淀法将四质粒共转染293包装细胞,将慢病毒载体上携带EGFP报告基因，12h后在荧光显微镜下均观察观察到绿色荧光蛋白表达(图4)，说明构建慢病毒载体有效。用流式细胞仪测得重组慢病毒的病毒滴度为106～107TU/mL。

　　3 讨 论

　　肝炎、肝纤维化和肝癌是常见肝病发展的“三步曲”，严重威胁人类健康。流行病学资料表明HCV感染和原发性肝细胞癌密切相关[1]，与HBV不同，HCV是一种正链RNA病毒,其复制周期中没有DNA阶段,也就是说它不是逆转录病毒。目前在分子病毒学上缺乏HCV致癌的理论根据，而HCV感染后表达的蛋白质在细胞转化中的作用受到研究者的关注。在HCV的众多基因片段中，core基因位于HCV 342～914nt间，长573nt，编码相对分子质量21×103(191aa，第1～191aa)的C蛋白。HCV核心蛋白是组成HCV核壳体的基本单位，它同时又是一种多功能蛋白。有实验证实核心蛋白有促进肝细胞增殖、非典型性增生的作用[2];HCV core可以在大鼠肝中持续表达，感染后的实验组大鼠部分细胞有恶性倾向[3];在对HCV转基因动物的研究中发现，转基因鼠的HCV核心蛋白的表达可导致肝脂变和HCC的发生。

　　越来越多的研究表明，干细胞也在肿瘤的发生发展中发挥重要作用。当肝细胞的增殖能力和功能受到损害时，肝脏干细胞发生增殖，并迁移到损坏的肝小叶替代损失的实质[46]。在HBV/HCV感染、药物和酒精性肝病等病理过程中，均可见到卵圆细胞的出现。新近的关于肝癌的研究,支持肝癌干细胞来源于正常肝脏干细胞转化的假说：卵圆细胞与肝癌发生。肝卵圆细胞具有分化为肝细胞和胆管细胞的双相潜能，这可能是某些肝癌同时具有肝癌、胆管癌表型的基础。STEINBERG等[7]将致癌剂转化的卵圆细胞移植到新生鼠皮下可新成为分化肝癌。DUMBLE等[8]在动物实验模型中诱导卵圆细胞增生，分离培养得到的永生化卵圆细胞在裸鼠中也具有成瘤性，其成瘤倾向提示卵圆细胞可能参与肝癌的发生。

　　通过研究核心蛋白对肝脏干细胞的转分化作用，有助于研究肝纤维化、肝肿瘤发生的机制。因为肝脏干细胞的特殊性，我们选择制备表达HCV core的重组慢病毒。

　　慢病毒(lentivirus, LV)[9]属逆转录病毒之一，包括灵长类慢病毒如人类免疫缺陷病毒(HIV)和猴免疫缺陷病毒(SIV)，以及非灵长类慢病毒如猫免疫缺陷病毒(FIV)、马传染性贫血病毒(EIAV)等。慢病毒在宿主细胞内能以病毒RNA为模板在自身反转录酶的作用下合成cDNA，再以此cDNA为模板合成双链DNA，经环化后通过病毒整合酶作用整合到宿主细胞的染色体上并长期表达。以慢病毒基因组为基础，除去其复制所需要的基因，代之以治疗基因和选择性标记物，构建而成慢病毒载体。对比其他种类的逆转录病毒载体一般仅感染处于分裂期的细胞，以HIVⅠ为代表的慢病毒载体可感染非分裂细胞及分裂细胞，因此成为一种有效的感染干细胞和进行基因治疗研究的工具。它可以使携带的基因整合至干细胞基因组内，且利用病毒携带的调控元件，使目的基因随干细胞特异性表达。人们已成功地应用慢病毒载体感染了神经细胞、肝细胞、造血干细胞、胰岛细胞、肌肉细胞、视网膜色素上皮细胞和气道上皮细胞。此外，慢病毒载体容纳外源性目的基因的片段大，可以在体内较长期的表达，不易诱发宿主免疫反应，安全性较好，可在更多范围的宿主细胞内生成高滴度的病毒。

　　慢病毒载体的构建原理是将HIV基因组中的顺式作用元件(如包装信号、LTR)和编码反式作用蛋白的序列分别存放于3～4个不同的质粒中，分别称为载体成分和包装成分。包装成分中剔除了HIVⅠ基因组包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列，能反式提供产生病毒颗粒所需的蛋白;载体成分与包装成分互补, 含有包装、逆转录和整合所需的HIVⅠ顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。目前运用最广泛的是由四质粒系统组成的第三代慢病毒载体。第三代HIVⅠ载体表达系统包含包装质粒、包膜质粒和转移质粒。包装质粒由两质粒组成，质粒1携带了gag/pol编码序列，编码Gagpol前体蛋白，并最终表达整合酶、逆转录酶及病毒结构蛋白;质粒2包含了编码rev的序列，编码Rev蛋白，其作用于转移质粒的顺式作用元件RRE，促使未经拼接的大mRNA分子从细胞核向胞浆转运。包膜质粒则通过引入VSVG基因表达包膜结构，编码VSVG蛋白来置换HIV病毒的外膜蛋白，使HIV载体感染宿主的范围扩大到几乎能感染所有组织来源的细胞，并赋予HIV载体颗粒高度的稳定性，使其能够通过超速离心而浓缩，达到高滴度。转移质粒则不仅包含HIV病毒复制所必须的顺式作用元件，还包含350bp的Gag序列以及组成Rev反应元件(RRE1的部分evn序列和剪切序列组成)，并在其中插入目的基因。

　　本实验利用PCR体系延伸互为模板的引物，通过T载体克隆法获得HCV coreAnt基因克隆，酶切后连人pLenti6/V5DTOPO质粒，得到pLenti6/V5DHCV

　　coreAnt，同pLP/VSVG和pLP1、pLP2四质粒共转染293ET细胞，获得了表达HCV coreAnt重组慢病毒。并且用类似的方法构建了表达EGFP的重组慢病毒。免疫组化实验证实细胞胞浆中有HCV core表达。使用表达EGFP的重组慢病毒感染3T3细胞见到绿色荧光。实验结果表明，通过分子克隆体外重组技术成功制备了表达HCV core的重组慢病毒，为下一步研究丙肝病毒致癌机制奠定了基础。

　　【参考文献】

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