黄芪预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用及其机制

　　【摘要】 目的 探讨黄芪对大鼠缺血再灌注心肌的保护作用及其机制。方法 采用结扎左冠状动脉的方法制备心肌缺血再灌注损伤动物模型。SD大鼠30只随机分为3组：对照组、缺血再灌注组(I/R)和黄芪预处理组(H+I/R)。光镜和透射电镜下观察心肌病理变化，检测血清肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量，以及心肌组织Na+K+ATP酶(Na+K+ATPase)、Ca2+ATP酶(Ca2+ATPase)活性。结果 ①黄芪预处理组光镜和透射电镜下心肌细胞变性坏死程度及心肌细胞超微结构形态改变较缺血再灌注组显著减轻;②黄芪预处理组大鼠血清中CK、LDH活性和MDA含量显著降低(P<0.05)，SOD、Na+ K+ATPase、Ca2+ATPase活性显著提高(P<0.05)。结论 黄芪对大鼠冠状动脉结扎后再灌注心肌损伤具有明显的保护作用，其机制可能与改善心肌缺血再灌注冠状微循环与抗氧自由基生成、减轻钙超载等多种机制有关。

　　【关键词】 黄芪;心肌;缺血再灌注损伤

　　Protective effects of Huangqi against ischemia /reperfusion injury in rats

　　WANG Wei, LIU Qining, ZHAO Xinjing

　　Department of Anesthesiology, the First Affiliated Hospital,Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China

　　ABSTRACT: Objective To study the effects and mechanism of Huangqi against myocardium injury induced by ischemia and reperfusion in rats. Methods Totally 30 male SpragueDauley rats were randomly divided into three groups: control group (C group), ischemia/reperfusion group (I/R group), ischemic pretreatment with Huangqi group (H+I/R group), with 10 rats in each. The left anterior descending (LAD) coronary artery was ligated to establish the ischemia/reperfusion heart model. Huangqi was administered before the model was established in the H+I/R group. The pathologic changes of myocardial tissues (under light and electron microscopy), content of creatine kinase (CK), lactate dehydrogenase (LDH), malondialdehyde (MDA) and the activity of superoxide dismutase (SOD) in serum, as well as activities of Na+K+ATPase and Ca2+ATPase in myocardial tissues were observed. Results Light and electron microscopic examination showed that the necrotic degeneration and pathologic changes of myocardiocytes in Huangqi group were significantly milder than those in the model group. The levels of CK, LDH, MDA were decreased significantly in Huangqi group (P<0.05), the activities of SOD, Na+K+ATPase and Ca2+ATPase in myocardial tissues in Huangqi group significantly increased (P<0.05). Conclusion Huangqi shows a significantly protective effect on myocardial I/R injury in rats. The mechanism may be related to multiple factors, including improving microcirculation, forming antioxygen free radicals and decreasing calcium overload.

　　KEY WORDS: Huangqi; myocardium; ischemiareperfusion injury

　　缺血一定时间的心肌在重新恢复血液供应后，不会马上恢复其正常功能和结构，反而出现心肌细胞损伤加重、心肌顿抑、心电不稳定，表现为心律失常、心功能低下等现象，即所谓的心肌缺血再灌注损伤。这些都会增加治疗的风险，增加病死率，因而如何提高心肌保护的效果成为心血管外科不断发展的要求。在心脏停跳液中添加辅助用药以减轻心肌的再灌注损伤是心肌保护的一大进步[1]。现代药理研究证明，黄芪补气培元，扶助心气，益气固表，黄芪中的黄芪总甙和黄芪多糖均能增加缺血心肌的血流灌注，减轻心肌损伤及抗自由基损伤的作用[24]。本研究旨在建立大鼠心脏缺血再灌注模型，初步探讨黄芪预处理对减轻心肌再灌注损伤的作用，以体现中医学动态、整体、联系的研究方法，为中药黄芪在心脏外科中的应用提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物

　　健康雄性SD大鼠30只，体重222～240g，购自西安交通大学医学院实验动物中心。随机分为3组，每组10只。对照组(生理盐水2mL bid×6d，ip)、缺血再灌注组(ischemia/reperfusion, I/R，生理盐水2mL bid×6d，ip)、黄芪预处理组(H+I/R;成都地奥黄芪注射液970143生药4g/2mL bid×6d, ip)。第6天处死缺血再灌注损伤(ischemiareperfusion injury，IRI)模型大鼠。

　　1.2 模型制作

　　采用鼠心冠状动脉左前降支结扎法[5]制作IRI模型。麻醉后气管插管、小型动物呼吸机支持(频率60～80min)、开胸、暴露心脏，以乳胶片垫底的0号丝线穿过左前降支中上1/3。对照组不结扎。所有实验组结扎40min(心肌缺血表现为心电图ST段明显上抬,结扎线以下心肌颜色变暗)后松开结扎线恢复再灌。于第6天处死大鼠，取心尖以上3mm处心肌组织标本。

　　1.3 检测指标及方法

　　1.3.1 心肌酶学

　　缺血再灌注4h后经腹主动脉采血。血清肌酸激酶(creatine kinase, CK)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)用化学比色法测定;丙二醛(malondialdehyde, MDA)用硫代巴比妥酸比色法;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性用黄嘌呤氧化酶法;心肌组织中Na+K+ATPase和Ca2+ATPase用无机磷测定法。

　　1.3.2 心肌组织病理学观察

　　将心肌置于100mL/L甲醛溶液中固定，石蜡包埋后常规切片，HE染色，光镜下观察病理变化。

　　1.3.3 心肌超微结构病理观察

　　取出心脏后迅速切取正常和缺血心肌1mm3大小各一块，置于4℃、30mL/L戊二醛中按电镜常规制样，透射电镜下观察拍照。

　　1.4 统计学处理

　　数据以均数±标准差(±s)表示，采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 光镜下病理观察

　　对照组：心肌纤维排列整齐，可见分支，偶见闰盘，细胞核位于肌纤维中央，心肌及间质未见异常(图1A)。缺血再灌注组：较大范围的心肌坏死灶，心肌萎缩，心肌纤维出现断裂、溶解、坏死，局部少量炎细胞浸润，心肌间质水肿，间隙增大(图1B)。黄芪预处理组：可见心肌坏死灶，其范围较模型组明显缩小;在心肌坏死灶内可见少数心肌纤维胞浆玻璃样变及呈现波浪状，但未见明显的心肌纤维断裂、溶解、坏死(图1C)。

　　2.2 心肌超微结构观察

　　对照组：心肌细胞超微结构基本正常(图2A)。缺血再灌注组：心肌细胞坏死，肌原纤维排列紊乱、断裂、溶解，Z线消失，肌浆网扩张，线粒体肿胀，线粒体嵴排列紊乱，细胞核形状不规则，核内染色质凝集，核膜溶解消失(图2B)。黄芪预处理组：心肌细胞肿胀，肌原纤维排列基本整齐，肌节基本完整，部分肌原纤维溶解，线粒体基本完整，嵴结构清晰，部分线粒体肿胀，电子密度降低，细胞核形态不规则，核内染色质分布均匀，核膜完整，核周无溶解区(图2C)。

　　2.3 黄芪预处理对缺血再灌注后大鼠血清CK、LDH活性的影响

　　缺血再灌注组血清CK、LDH活性显著高于对照组(P均<0.01)。黄芪处理组CK、LDH显著低于I/R组(P<0.05，表1)。表1 黄芪预处理对缺血再灌注后大鼠血清中CK、LDH、SOD活性、MDA含量以及心肌组织中Na+K+ATPase和 Ca2+ATPase活性的影响(略)

　　2.4 黄芪预处理对缺血再灌注后大鼠血清MDA含量和SOD活性的影响

　　与对照组相比，缺血再灌注组血清SOD活性明显降低(P<0.05)，MDA含量升高(P<0.05);黄芪处理组血清SOD活性高于缺血再灌注组，MDA含量均低于缺血再灌注组(P<0.05，表1)。

　　2.5 黄芪预处理对缺血再灌注后大鼠心肌组织中Na+K+ATPase和Ca2+ATPase活性的影响

　　与对照组相比，缺血再灌注组大鼠心肌组织中Na+K+ATPase和Ca2+ATPase活性均降低(P<0.05)，黄芪预处理组Na+K+ATPase和Ca2+ATPase活性均显著高于缺血再灌注组(P<0.05)。

　　3 讨 论

　　心肌缺血再灌注损伤过程中产生大量氧自由基，进而引发链式的脂质过氧化反应，使细胞结构和功能的完整性受到破坏。自由基还可能通过以下途径损伤心肌细胞：①作用于细胞膜，引起膜发生脂质过氧化，从而影响细胞信号转导系统; ②直接损伤DNA，诱发细胞凋亡;③影响核基因转导，改变细胞的表型特征，诱发细胞凋亡;④攻击蛋白质，使具有酶活性的蛋白质活性丧失或减弱。近年来随着传统医学的发展, 中药在心血管疾病防治中的作用越来越受到重视[6]。祖国传统医学认为在心肌缺血再灌注损伤的发生过程中，心肌缺血是基本病因。由于较长时期心肌缺血、缺氧, 直接导致心肌失养而存在着不同程度的心气亏虚。缺血期间局部心肌血脉流行不畅，血液不能正常循行，再灌注之后，因心气亏虚、运血无力，终致血行瘀阻。因此，气虚血瘀是心肌缺血再灌注的基本病理变化之一，而应用益气养阴、活血化瘀的方药能有效改善心肌缺血再灌注冠状微循环。

　　CK、LDH广泛存在于细胞浆内, 故心肌细胞损伤时，二者即进入血液中，活性升高。SOD是体内清除氧自由基的抗氧化酶系统成员之一，对体内氧化和抗氧化平衡起着非常重要的作用，可清除超氧阴离子，保护细胞免受氧自由基损伤。因此，测定SOD活性能反映机体内抗脂质过氧化的能力。MDA是氧自由基脂质过氧化的最终产物，可破坏细胞膜，使细胞内Ca2+严重超负荷，线粒体合成三磷酸腺苷(ATP)的量明显减少，进而抑制心功能，引起严重的心律失常，最终导致心肌细胞死亡。因此，测定MDA含量能间接反映氧自由基的含量和脂质过氧化的程度。钙超载是心肌缺血再灌注损伤中重要的损伤机制，被认为能促进自由基的过氧化损伤。Ca2+在细胞内聚集，引起膜受损和膜通透性增强，损伤线粒体。Na+K+ATPase和Ca2+ATPase是细胞膜上的重要离子通道，具有对抗钙超载的作用。心肌组织Na+K+ATPase对维持跨心肌膜的不对称钠、钾分布及调节心肌电兴奋性起重要作用，心肌膜Na+K+ATPase也参与心脏功能和代谢调节。黄芪是临床常用的补气中药，具有补气固表、托毒生肌、利水的功效,能拮抗自由基并能增加心肌细胞膜Na+K+ATP酶的活性，还具有改善能量代谢、保护心功能等综合作用[7]。英明中等[8]将黄芪总黄酮溶于灌注液，以大鼠心脏造成心肌缺血再灌注模型，也证实了黄芪具有清除氧自由基的能力。本实验病理观察发现，接受同等程度缺血/再灌注损伤，经过黄芪预处理，在光镜下可见心肌坏死灶，其范围较模型组明显缩小。在心肌坏死灶内可见少数心肌纤维胞浆玻璃样变及呈现波浪状，但未见明显的心肌纤维断裂、溶解、坏死。电镜下心肌超微结构显示其病理变化明显减轻，肌原纤维排列基本整齐，线粒体基本完整，嵴结构清晰，基本接近正常。与模型组肌原纤维排列紊乱、断裂，线粒体肿胀，嵴排列紊乱比较，心肌损伤明显减轻。上述病理学的变化更直观的阐明黄芪对大鼠心肌缺血/再灌注损伤具有保护作用。另外本实验结果显示，黄芪预处理组再灌注后心肌酶含量低于对照组。LDH作为胞浆中的酶，只有在细胞大量受损时才可能大量溢出，因此可作为细胞膜损伤的间接指标。本实验发现缺血再灌注时LDH明显升高，与对照组相比,黄芪注射液能部分抑制再灌注期间LDH的升高,在一定程度上表明其对心肌再灌注损伤有保护作用。本实验结果显示，大鼠心肌缺血再灌注后，血清中的SOD活性明显降低，MDA大量生成。黄芪预处理组可以明显提高血清中SOD活性及心肌组织中Na+K+ATPase和Ca2+ATPase活性，降低MDA的生成量，从而表现出减轻缺血再灌注导致的损伤乃至心肌细胞的凋亡。其机制可能是通过激活抗氧化酶，提高SOD活性，清除H2O2和OH的前身O2，减少过多氧自由基对组织的损伤;同时对抗钙超载作用，通过Ca2+拮抗剂样作用阻止Ca2+内流，增加肌浆网Ca2+摄取，减少胞浆游离Ca2+浓度，阻断Ca2 +超载引起的心肌细胞损伤加重[9]，使内皮细胞损伤减轻, 从而减轻了生物膜、离子泵及整个心肌细胞的损伤，最终表现出对心肌缺血再灌注损伤的保护作用，但其作用的起始点及途径有待于进一步研究。

　　【参考文献】

　　[1]MOUKARBEL GV, AYOUB CM, ABCHEE AB. Pharmacological therapy for myocardial reperfusion injury [J]. Curr Opin Pharmacol, 2004, 4(2):147153.

　　[2]阮长武，张代富，王姗姗，等. 黄芪对缺血再灌注心肌细胞凋亡的影响 [J]. 同济大学学报(医学版), 2003, 24(3):182184.

　　[3]王瑞. 黄芪中不同成分对大鼠心肌缺血再灌注损伤的心功能影响 [J].中国药学杂志, 2000, 25(5):89.

　　[4]单俊杰，王顺春，刘涤，等. 黄芪多糖体的化学和药理研究进展 [J]. 上海中医药大学学报, 2000, 14(3):6265.

　　[5]齐志敏，王倩，张莹. 大鼠心肌缺血再灌注损伤实验模型研究 [J]. 中国临床康复, 2004, 8 (30):66206621.

　　[6]贺运河，陈镜合. 中药抗心肌缺血再灌注损伤的机制研究现状 [J]. 中西医结合心脑血管病杂志, 2004, 2(3):165167.

　　[7]贺运河，陈镜合. 中药抗心肌缺血 再灌注损伤的机制研究现状 [J]. 中西医结合心脑血管病杂志, 2004, 2(3):165167.

　　[8]英明中，李小鹰，孙有普，等. 黄芪总黄酮对大鼠心肌缺血再灌注自由基的影响 [J]. 中国中药杂志, 1996, 21(5):3043051.

　　[9]郑曙云，徐建国，赵振中. 参附注射液对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响 [J]. 中国中西医结合杂志, 2004, 24(6):54154.