耐亚胺培南鲍曼不动杆菌的耐药性分析及金属β-内酰胺酶的检测

　　【摘要】 目的 了解我院鲍曼不动杆菌的耐药性及其产金属β-内酰胺酶(MBLs)的情况。方法 采用K-B纸片扩散法测定13种抗菌药物的耐药性;分别用金属螯合剂乙二胺四乙酸(EDTA)和2-巯基丙酸抑制试验测定鲍曼不动杆菌产金属β-内酰胺酶的情况。结果 91株鲍曼不动杆菌中有23株对亚胺培南耐药，其仅对阿米卡星和米诺环素耐药率较低，分别为21.7%和26.1%;对头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦和环丙沙星部分耐药，耐药率分别为52.2%、43.5%和65.2%;对头孢吡肟耐药率非常高(91.3%);对氨苄西林/舒巴坦、庆大霉素、头孢噻肟、头孢他啶、复方磺胺和美罗培南全部耐药;与亚胺培南敏感组比较，除阿米卡星、环丙沙星、米诺环素外，亚胺培南耐药组对其他抗生素的敏感率明显降低、耐药率明显增高(P<0.05)。23株耐亚胺培南鲍曼不动杆菌金属β-内酰胺酶的检出率为65.2%(15/23)。结论 耐亚胺培南不动杆菌的耐药现象非常严重，临床应根据药敏结果合理选用抗生素; 金属β-内酰胺酶的产生是鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药的重要机制之一，实验室应加强对产酶菌株的监测。

　　【关键词】 鲍曼不动杆菌 ;金属β-内酰胺酶;亚胺培南;耐药性

　　鲍曼不动杆菌是医院感染的重要条件致病菌。广泛分布于人体的皮肤表面、工作台面、毛巾、工作服、墙壁及呼吸器械等处。近年来不动杆菌感染的病例逐年增加，成为仅次于铜绿假单胞菌的重要非发酵菌，居院内感染第4位[1]，碳青霉烯类抗生素对不动杆菌有很好的抗菌活性[1-2]。但随着碳青霉烯类抗生素的广泛使用，耐亚胺培南的不动杆菌的报道逐年增加，国内外均出现耐亚胺培南不动杆菌耐药克隆株的暴发流行，并产生多重耐药的现象[1-3]，已引起临床医生及微生物工作者的高度关注。目前认为产金属β-内酰胺酶(metallo-β-lactamases, MBLs)是该菌对碳青霉烯类抗生素耐药的重要机制之一。为了了解我院鲍曼不动杆菌的耐药性及其产金属酶情况，我们检测了91株鲍曼不动杆菌临床分离株对13种抗生素的耐药谱，并对23株耐亚胺培南鲍曼不动杆菌产MBLs进行初步筛选。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 菌株来源

　　收集西安交通大学医学院第一附属医院2007年7月～2008年6月住院患者的非重复分离株91株，菌株经法国梅里埃全自动微生物鉴定仪VITEK 2鉴定，菌株以250mL/L的甘油肉汤-20℃保存备用。质控菌株：大肠埃希菌ATCC25922和铜绿假单胞菌ATCC27853购自卫生部临床检验中心;金属酶阳性质控菌株为产IMP-1型金属酶的铜绿假单胞菌。

　　1.1.2 药敏纸片

　　所有药敏纸片均为英国OXID产品。包括：阿米卡星(Amikacin，30μg)、头孢噻肟(Cefotaxime，30μg)、头孢他啶(Ceftazidime，30μg)、头孢吡肟(Cefepime，30μg)、亚胺培南(Imipenem，10μg)、美罗培南(Meropenem，10μg)、庆大霉素(Gentamycin，10μg)、复方磺胺(Trimethoprim/sulfamethoxazole, 12.5/23.75μg)、哌拉西林/他唑巴坦(Piperacillin/tazobactam，100/10μg)、头孢哌酮/舒巴坦(Cefoperazone/sulbactam，75/75μg)、氨苄西林/舒巴坦(Ampicillin/sulbactam，10/10μg)、环丙沙星(Ciprofloxacin，5μg)、米诺环素(Minocycline，30μg)。

　　1.1.3 仪器和试剂

　　全自动微生物鉴定系统VITEK 2为法国生物梅里埃生产;水解酪蛋白(MH琼脂)为OXID公司产品;乙二胺四乙酸(EDTA)为重庆化学试剂厂产品。

　　1.2 方法

　　1.2.1 药敏试验

　　采用K-B纸片扩散法。严格按照临床实验室标准化研究所(CLSI)推荐的纸片扩散法测定多种抗生素的抑菌环直径，按CLSI2008年M100-S18规定折点判断耐药(R)、中介(I)及敏感(S)[4]。数据分析采用WHONET5.4软件;数据的统计分析采用卡方检验，以P<0.05为有显著性差异。

　　1.2.2 纸片法测定MBLs

　　根据文献[5-6]略做改进，采用两种方法检测。①头孢他啶+2-巯基丙酸： 将待检菌株按常规药敏均匀涂布于MH平板，分别贴两片头孢他啶纸片，纸片中心相距2.5cm，其中一片加入3μL 2-巯基丙酸原液;在另一侧贴空白纸片，其中一片也加入3μL 2-巯基丙酸原液，35℃孵育18～24h。若加试剂的纸片抑菌环直径扩大4mm以上则为阳性，提示产MBLs。②亚胺培南+EDTA法：0.5麦氏单位待测菌菌液均匀涂布MH琼脂平板，中间贴亚胺培南和头孢他啶纸片，纸片相距4cm。 在距纸片1.5cm处分别贴一空白纸片，均匀加入0.5mol/L EDTA 10μL，35℃培养过夜。若两纸片有协同作用，为产金属酶株。

　　2 结 果

　　2.1 菌株分布

　　91株鲍曼不动杆菌中，来源于痰标本(主要为无菌吸痰和支气管灌洗液)76株(83.5%)、尿标本2株(2.2%)、伤口分泌物5株(5.5%)、腹腔引流液3株(3.3%)、静脉导管尖端3株(3.3%)、血液标本2株(2.2%);按病区分布，中心ICU 62株(68.1%)、呼吸RCU 8株(8.8%)、呼吸科10株(11.0%)、神经外科ICU 8株(8.8%)、肝移植科3株(3.3%);耐亚胺培南IMP鲍曼不动杆菌分布，ICU 20株(86.9%)，非ICU 3株(13.0%)。结果显示，呼吸道标本远高于其他，而且ICU病房分离率远远高于其他病区。

　　2.2 药敏结果

　　91株鲍曼不动杆菌分为亚胺培南敏感组(68株)和耐药组(23株)，耐药组的药敏结果显示，敏感率较高的抗生素有阿米卡星(78.3%)和米诺环素(65.2%)，其次为头孢哌酮/舒巴坦(43.5%)、哌拉西林/他唑巴坦(34.8%)和环丙沙星(30.4%)，对其他抗生素氨苄西林/舒巴坦、复方磺胺、头孢他啶、庆大霉素几乎全部耐药(表1)。按文献[1]将对亚胺培南、头孢他啶、环丙沙星或阿米卡星三个或三个以上耐药的细菌称为多耐药菌(MDR)，本实验中MDR多重耐药发生率达到58%。与亚胺培南敏感组比较，除阿米卡星、环丙沙星、米诺环素外，亚胺培南耐药组对所有抗生素的敏感率降低、耐药率增高(P<0.05)。表1 鲍曼不动杆菌对各种抗菌药物的敏感率和耐药率(略)与亚胺培南敏感组比较，*P<0.05。

　　2.3 MBLs检测结果

　　用头孢他啶+2-巯基丙酸法检出产金属酶12株(52.2%)，亚胺培南+EDTA法检出10株(43.5%)，两种方法同时阳性8株，头孢他啶+2-巯基丙酸法单独阳性4株，亚胺培南+EDTA法单独阳性2株，头孢他啶与EDTA有协同作用1株(图1)。

　　3 讨 论

　　随着碳青霉烯类抗生素的广泛使用，耐亚胺培南的鲍曼不动杆菌的报道逐年增加[7]，国内外均出现耐亚胺培南不动杆菌耐药克隆株的暴发流行[1,3]。在西班牙，不同医院耐亚胺培南的不动杆菌的分离率为13.5%～85%，平均为44.9%，并对多种抗生素耐药[8]。本研究数据显示，我院耐亚胺培南的鲍曼不动杆菌的分离率为25.3%，多重耐药的鲍曼不动杆菌达到58%，明显高于2006年国内监测数据21.9%和53%[9]。可能与我院大量使用碳青霉烯类抗生素治疗感染有关。在所分离的菌株中，呼吸道标本占83.5%，远高于其他类型标本，而且主要集中在ICU病房，说明鲍曼不动杆菌是呼吸道感染的主要病原菌，与院内获得性呼吸系统感染尤其是机械通气关系密切。对于耐亚胺培南的鲍曼不动杆菌，抗菌活性较好的有阿米卡星、米诺环素、头孢哌酮/舒巴坦和哌拉西林/他唑巴坦。有报道，多粘菌素对耐亚胺培南的鲍曼不动杆菌有很好的抗菌活性。

　　细菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制主要是产生碳青霉烯酶。碳青霉烯酶是指能够水解亚胺培南或者美罗培南的一类β-内酰胺酶，包括Ambler分类中的A、B、D三类酶[10]，在不动杆菌中发现的碳青霉烯酶主要为B类和D类酶[1-2,11]，D类为苯唑西林酶(OXA类酶),B类为金属酶，属于Bush分群的第三组，由于β-内酰胺酶活性位点有Zn离子的参与，故称金属酶。目前国内外已发现的鲍曼不动杆菌中的金属酶主要有IMP-型和VIM-型[12]。金属酶的出现令临床治疗陷入困境，主要原因为：它具有广泛水解包括碳青霉烯类在内的β-内酰胺类抗生素的能力，而且对常用的β-内酰胺酶抑制剂如克拉维酸、舒巴坦、他唑巴坦敏感性差;产酶基因大多由质粒、转座子或整合子等可移动元件介导, 易于传播;不动杆菌中，碳青霉烯酶基因、氨基糖苷修饰酶基因通常位于一个整合元件中而介导多重耐药[13]。本研究结果也证实了这一点，耐亚胺培南的鲍曼不动杆菌，对多数抗生素如头孢类、庆大霉素等耐药，多重耐药的检出率也非常高(约60%)。

　　对于金属酶的表型检测目前国际上还没有统一的标准，本试验采用的方法是根据文献报道略加改进。因为金属酶的活性激活需要Zn离子的存在，所以用金属离子的螯合剂可以导致金属酶失活，抑菌圈增大。使用较多的螯合剂是EDTA，也有国外学者报道使用2-巯基丙酸效果优于EDTA[5]，国内也有相同或相似的方法[14-15]。本研究采用两种方法共检出产金属酶15株(65.2%)，与国内宗志勇[15]报道相近，用头孢他啶+2-巯基丙酸法检出产金属酶12株(52.2%)，亚胺培南+EDTA法检出10株(43.5%)，两种方法同时阳性8株，头孢他啶+2-巯基丙酸法单独阳性4株，亚胺培南+EDTA法单独阳性2株，头孢他啶与EDTA有协同作用1株。有报道对头孢他啶耐药的菌株也可能产MBLs[16]。实验发现用2-巯基丙酸法检测MBLs结果更易于判断，这与国外报道一致[5]。而EDTA协同实验因为纸片的距离不易掌握会出现不同的实验结果，受纸片距离影响较大，而且也会受主观因素影响。如果要进一步确定金属酶的基因型，可采用PCR等其他分子生物学方法证实，但对一般实验室来讲操作复杂、费时，不宜常规开展，所以作为筛查的方法，用巯基丙酸双纸片法检测金属酶快速、简便，值得在临床实验室推广。

　　总之，碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌和多耐药不动杆菌的暴发流行及逐年增多，给医务工作者再次敲响了警钟，临床医生一定要注意合理用药，而实验室工作人员应加强耐药菌的监测以及对产酶菌株进行筛选，及时发现产酶菌株，以便早期预防，同时配合医院控感部门，做好感染控制工作，防止产酶菌的暴发流行。

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