Bmi1在乳腺癌组织中的表达及相关性研究

　　【摘要】 目的 研究Bmi1在乳腺癌组织和癌旁组织中的表达，探讨其与乳腺癌临床病理特征的关系。方法采用免疫组化SP法检测60例乳腺癌组织中Bmi1蛋白的表达情况，并结合患者的临床病理资料分析与其相关性。结果 60例乳腺癌标本中有49(81.7%)例强阳性表达。统计分析结果发现Bmi1的强阳性表达与乳腺癌的淋巴结转移及临床分期密切相关(P<0.05)，而与肿瘤大小及雌激素受体、孕激素受体、cerbB2、血管内皮生长因子等临床病理特征无显著性相关(P>0.05)。结论 Bmi1蛋白在乳腺组织中的高表达与乳腺癌的进展相关，预示肿瘤具有高度转移潜能，Bmi1可能成为预测乳腺癌转移的标志物。

　　【关键词】 乳腺癌;Bmi 1;免疫组织化学

　　Expression and Clinical Significance of Bmi1 Oncogene in Breast Cancer

　　ZHOU Xiaoyun,XU Zhengshun,LI Huixiang,et al

　　(Medical College, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China)

　　Abstract:Objective To evaluate the expression and significance of Bmi1 in breast cancer. Methods The expression and significance in 60 specimens of breast cancer were detected by immunohistochemistry.The correlation of Bmi1 expression to clinicopathologic features of breast cancer was analyzed. Results The intensive positive expression of Bmi1 was detected in 49(81.7%) of the 60 tumors.The intensive expression of Bmi1 was positively correlated to clinical stage and lymph node metastasis(P<0.05)，but not to tumorsize，estrogenreceptor(ER),progesterone receptor(PR), cerbB2 and vascular endothelial growth factor(VEGF) expression(P>0.05). Conclusion The intensive expression of Bmi1 in breast cancer is related to tumor progression. Bmi1 may serve as a new molecular marker of metastasis of breast cancer.

　　Key words:breast cancer;Bmi1;immunohistochemistry

　　Bmi1基因(B cellspecific murine leukemia vivus integrationsite1，Bmi1)属于多梳基因家族(Polycome of genes，Pcg)成员，与cmyc协同作用引起细胞转化和肿瘤形成，参与细胞增殖调控。Bmi1对于造血干细胞自我更新及分化潜能的维持至关重要，并在部分血液系统恶性疾病，包括白血病及淋巴瘤的发生和发展中发挥重要作用[1]。有报道Bmi1在霍奇金淋巴瘤及结肠癌、小细胞肺癌等多种肿瘤中均有高表达。最近的研究还发现其在鼻咽癌中也呈高表达[2]。本研究旨在通过检测Bmi1在乳腺癌组织中的表达，以探讨其与乳腺癌临床病理特征的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 临床资料 从郑州大学第一附属医院病理科2004年12月～2005年9月保存的乳腺癌病理标本中随机选取病理号尾数为5和9病例资料完整的60例病理标本。所有病例均经术后组织病理学确诊。患者均为女性，其中浸润性导管癌56例，其他类型4例( 包括浸润性小叶癌2例，导管内原位癌1例，小叶原位癌1例);肿瘤直径≤2 cm 者39例，>2 cm者21例。根据国际抗癌协会( UICC) 2002年的TNM分期法，临床分期为Ⅰ/Ⅱ期者38例，Ⅲ/Ⅳ期者22例;60例病例中有31例发生淋巴结转移，29例无淋巴结转移。所有病例均检测了雌激素受体(estrogen receptor,ER) 和孕激素受体(progesterone receptor, PR)、VEGF及cerbB2的表达。所有组织标本均经10%甲醛固定，石蜡包埋。

　　1.2 试剂与方法 采用免疫组化SP法，石蜡标本行4 μm厚连续切片，鼠抗人Bmi1单克隆抗体购自美国upstate公司, 稀释度为1∶200;SP免疫组化试剂盒购自北京中杉公司。阴性对照以TBS取代一抗。免疫组化SP法检测乳腺癌组织中Bmi1的具体方法如下：先将切片置于二甲苯中脱蜡, 每次10 min，共2次，乙醇梯度水化处理(无水乙醇95%、无水乙醇90%和无水乙醇70%各5 min)，蒸馏水冲洗3次，每次5 min;EDTA(pH 8.0)修复液常规修复, 微波炉中高火3 min预热至其沸腾，中低火20 min加热以充分暴露抗原位点,待其自然冷后，PBS(1‰)冲洗3次，每次5 min;3%H2O2去离子水孵育10 min，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗3次，每次3 min;滴加鼠抗人Bmi1(稀释度1∶200 Upstate,USA)4℃孵育过夜，PBS漂洗3次，每次5 min;滴加A液( 北京中杉SPKIT)室温孵育15 min，PBS漂洗3次，每次5 min;再加B液(北京中杉SPKIT)室温孵育10～15 min，PBS漂洗3次，每次5 min，DAB显色10 min，终止显色，苏木精复染，盐酸乙醇固定，中性树胶封片，观察。用PBS液代替一抗做阴性对照。

　　1.3 结果判断 光学显微镜下观察组织标本的着色程度Bmi1蛋白阳性表达主要表现为细胞核内呈现棕黄色或者棕褐色颗粒，也有少量胞浆内呈现棕黄色颗粒。高倍镜下(放大400倍)随机取4个不同的视野，计数细胞总数及核阳性细胞数，按阳性细胞所占的百分比计分：阳性细胞率≤10%为1分，阳性细胞率>10%且≤50%为2分，阳性细胞率>50%且≤75%为3分，阳性细胞率>75%为4分;同时，根据染色的强弱程度计分：阴性染色1分,弱染色2分,中等强度染色3分,强染色4分;根据二者的乘积判断结果：≤4分为(-)，>4且≤8为(+)，>8且≤12为(++)，>12且≤16为(+++)。统计分析时(-)和(+)合计为阴性或弱阳性表达，(++)和(+++)合计为强阳性表达。以上结果均至少由两位病理科医生以双盲法观察确定。

　　1.4 统计学分析 用SPSS 13.0统计软件对数据采用卡方检验、四格表确切概率法及相关性分析，以P<0.05为有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 Bmi1在乳腺癌组织中的表达 Bmi1在乳腺癌组织中的表达见图1。60例乳腺癌标本中Bmi1的强阳性率为81.7%(49/60)。阳性表达主要集中在癌细胞核中，其中核强阳性率达73.3%(44/60)。

　　2.2 Bmi1在乳腺癌组织中的表达与临床病理特征的关系 60乳腺标本中，淋巴结阳性的有31例，其中Bmi1强阳性表达29例，占96.6%;淋巴结阴性的有29例，其中Bmi1强阳性表达21例，占68.8%(见图1)。经统计学分析，两组中Bmi1强阳性率差异有显著性(P<0.05);Spearman相关性分析得出Bmi1与乳腺癌的淋巴结转移之间呈正相关(r=0.365，P=0.005)。60乳腺标本中，临床分期为Ⅰ/Ⅱ期的有38例，其中Bmi1强阳性表达28例，占73.7%;临床分期为Ⅲ/Ⅳ期的有22例，Bmi1强阳性表达为95.5%。经统计学分析，两组中Bmi1的强阳性表达有显著性差异(P<0.05，表1)，Spearman相关性分析显示Bmi1与乳腺癌的临床分期呈正相关(r=0.331, P=0.011) 。60例乳腺癌组织Bmi1的强阳性表达在其他方面如：肿瘤大小、ER、PR、cerbB2和VEGF等均无统计学差异(见表1)。表1 Bmi1 的表达与乳腺癌临床病理特征的关系

　　3 讨论

　　Bmi1基因是荷兰癌症中心1991年在研究转基因鼠的淋巴瘤细胞传代中被发现的。它具有阻抑子(repressor)的功能，可以阻断细胞周期中两种关键抑制蛋白，并发现其可与cmyc协同作用引起细胞转化和肿瘤形成[2]。Bmi1蛋白属于转录抑制因子Ploycomb基因家族成员，其蛋白表达在细胞质、染色质和染色体。可结合于基因中的Ploycomb反应元件，使特异靶基因转录沉默。

　　Bmi1可能通过不同的途径与乳腺癌浸润转移相关基因相互作用，在转录或翻译水平调控肿瘤的浸润转移。一方面Bmi1作为细胞癌基因，一旦被激活高表达于乳腺癌细胞中，在调节细胞周期中起重要作用。Bmi1基因通过结合INK4a位点，下调p16INK4a和p19ARF的表达，从而抑制由pRb和p53蛋白介导的细胞凋亡，导致细胞的永生化甚至肿瘤化。①p16INK4a/CDK/pRb通路：在G1期，CDK4/6活化后，磷酸化一系列靶蛋白，包括Rb。Rb通常与转录因子E2F家族成员结合，阻止后者的转录活性。Rb功能丧失的结果是E2F的转录活性处于无控制状态，使细胞失去了控制G1/S期转换的一个重要机制。当Bmi1高表达时，p16INK4a表达下调，对cyclinD/CDK4/6复合物的抑制作用减弱，从而使Rb蛋白高磷酸化。高磷酸化的pRb与E2F的结合作用减弱，使后者从E2F1pRb复合物中解离出来，启动DNA复制相关基因的转录，延长细胞的增殖期，阻止细胞凋亡。②p19ARF/MDM2/p53通路：p53基因编码p53蛋白，p53蛋白具有特异的转录激活作用，还参与DNA修复、凋亡等过程。当Bmi1高表达时，抑制p19ARF的表达，使其对原癌蛋白小鼠双微 2 (murine double minute2，MDM2)的抑制作用减弱，这样MDM2介导的泛素依赖p53蛋白降解增多，p53缺失的细胞发生DNA损伤后，不能通过p53的介导停滞在G1期进行DNA修复，细胞继续增殖，DNA的异常传递给子代细胞，这些异常的积累最终细胞肿瘤化。 在转基因鼠中，Bmi1 表达缺失导致其神经功能上的缺失，还引起淋巴细胞生命周期严重停滞，而过表达Bmi1的转基因鼠则引发了鼠的淋巴瘤。因此，有可能因Bmi1下调P16INK4a和p19ARF表达而导致高表达Bmi1 的乳腺癌细胞生命周期延长增殖旺盛。

　　另一方面，Bmi1还可激活端粒酶逆转录酶的转录并诱导端粒酶的活性，阻止细胞衰老。Harley等[3]提出的肿瘤细胞永生化的“端粒-端粒酶-肿瘤产生”假说已得到许多研究结果的支持。染色体末端存在的称为端粒的DNA重复序列，其长度随细胞的每一次复制逐渐缩短。细胞复制一定次数后，短缩的端粒使染色体相互融合，导致细胞死亡。端粒酶则可使缩短的端粒长短恢复。乳腺癌中高表达Bmi1可激活细胞中的端粒酶活性，使其端粒不会缩短，由此导致细胞的永生化(immortality)。Bmi1基因也可能在蛋白水平直接与肿瘤浸润转移相关因子发生作用。 但有关这方面的文献报道极少，有待进一步研究。

　　淋巴结转移和临床分期均与乳腺癌的诊治和预后关系密切, 临床分期高和/或出现淋巴结转移患者多数预后不良。本实验结果表明, 乳腺癌组织中Bmi1的高表达与临床分期及淋巴结转移成正相关性, 提示Bmi1在乳腺癌晚期发生浸润转移的过程中可能起重要作用。国外有文献报道Bmi1能诱导乳腺上皮永生化[4]，在有淋巴结转移的乳腺癌组织中Bmi1的表达高于无转移的病例, 其与乳腺癌的发生发展存在正相关性, 这与本研究结果一致;但该文献还发现Bmi1的表达与ER的表达也有正相关性, 这与本研究结果不一致, 可能因样本量的不同得出不同的结论, 若扩大样本量, 我们有可能也得出与该研究结果一致的结论。另外, 这种不一致性也可能是中国人与西方人在人种上的差异。乳腺癌组织中Bmi1的高表达与PR、VEGF、CerbB2及肿瘤大小等无明显相关性，这与国内外众多研究结果均一致[5]。综上所述，Bmi1可能在乳腺癌发生浸润转移的晚期起到重要作用，乳腺癌细胞高表达Bmi1与肿瘤进展相关, 预示肿瘤具有高度转移潜能，提示Bmi1可能成为预测乳腺癌高度转移的新标志物，有可能为乳腺癌的预后判断和治疗提供新的理论依据。

　　【参考文献】

　　[1] VanLohuizen M,Frasch M,Wientjens E,et al.Sequence similarity between them ammalian bmi1protooncogene and the drosophila regulatory genes pscand Su(z)2[J].Nature,1991;353( 6342):353-355.

　　[2] Alkema MJ，Wiegant J,Raap AK，et al.Characterization and chromosomal localization of the human protooncogene Bmi1[J].Hum Mol Genet,1993,10 (2):1597-1603.

　　[3] Park IK,Qian D,Kiel M,et al.Bmi1 is required for maintenance of adult selfrenewing haematopoietics temcels[J].Nature,2003,423(6937):302-305.

　　[4] Dimri GP,Martinez JI,Jacobs JJ,et al.The Bmi1 oncogene induces telomerase activity and immortalizes human mammary epithelial cells[J].Cancer Res, 2002, 62(16):4736-4745.

　　[5] 冯艳.Bmi1在乳腺癌组织中的表达[J].Cancer,2007,26(2)：154-157.