大鼠锥体束显微结构的三维重建方法研究
作者：季达峰，韩笑，吴辉群，孙洲，李耀富，汤乐民，吕广明 作者单位：(南通大学医学院1人体解剖学教研室、神经生物学研究所，医学信息学教研室2，影像工程学教研室3，南通226001)
【摘要】 目的：探讨构建神经纤维束显微结构三维可视化模型的实用方法。方法：SD大鼠全脑连续冰冻切片经Luxol Fast Blue染色显示锥体束。采用分区显微摄影法，获取每张脑组织切片的二维图像。运用Photoshop7.0软件对每张脑片的图像进行拼接，根据三轴定位法对拼接图像进行配准，导入3D-DOCTOR4.0软件对脑和锥体束进行表面重建和体素重建。利用3DMAX8.0软件对重建模型进行可视化处理。结果：重建出SD大鼠脑和锥体束全貌模型清晰逼真，可以在任意断面从不同角度观察锥体束的显微结构，动态显示锥体束在脑内的立体行径。结论：基于连续组织切片的三轴定位法结合三维重建软件可以真实地再现锥体束的显微结构及其在脑内的三维立体行径，为神经纤维束的损伤修复研究提供精确的三维立体形态学基础。
【关键词】 连续切片;三维重建;锥体束;大鼠
Three dimensional reconstruction methods on the microstructure of the rat pyramid tract
JI Dafeng1, HAN Xiao1, WU Huiqun2,et al (1Department of Human Anatomy, Institute of Neurobiology, 2Department of Medical Informatics, 3Department of Image Engineering, Medical School, Nantong University3, Nantong 226001)
[Abstract] Objective: To explore the applicated methods for 3D visualization model of the microstructure of the rat neural fasciculus. Methods: The pyramidal tracts of the rat brain were revealed by the Luxol Fast Blue(LFB) staining method on the serial brain sections. The 2D images were obtained by the partitional microphotography on each brain section. The images of each brain section were stitched and registrated according to the three-axis location system in the Photoshop7.0 software. The registrated images were imported into the 3D-DOCTOR 4.0 reconstruction system to make the surface reconstruction and the volume reconstruction of the brain and the pyramidal tracts. The reconstructed pyramidal tract models were visulized in the 3DMAX8.0 software. Results: The whole shape of the brain and the pyramidal tract were reconstructed clearly and vividly, the reconstructed microstructure of the pyramidal tracts can been observed in different angles at any cross section, the 3D stereopathway of pyramidal tracts was dynamically displayed. Conclusion: These results show that the microstructure of pyramidal tract and its stereopathway in the brain can be actually and acurately reconstructed and re-appeared by the three axis location system based on the serial sections, thus provides an acurate 3D morphological base for the research on the neural foasciculus damage and repairing.
[Key words] Serial sections; Three dimensional reconstruction; Pyramidal tract; Rat
随着影像技术、显微摄影技术和计算机技术的发展，生物组织结构的计算机三维重建和数字可视化研究逐渐成为生物形态学的一大热点。通过对动物骨骼[1]、血管[2]、内脏[3]以及神经系统[4]的三维可视化研究推动了数字化技术在生物医学领域的应用。对生物大体形态的三维可视化研究目前多采用影像学手段，但影像学手段一般不适用于对生物内部显微结构的表现，而铣切方法如“虚拟人”[5]是通过原始的铣切-拍摄的方法对人体进行三维重建和可视化研究，同样难以清晰显示生物体内部的显微结构。有鉴于此，本研究旨在探索生物组织显微结构三维重建的有效方法。
1 材料和方法
1.1 连续切片 选取健康成年雄性SD大鼠4只，体重(250±5) g(南通大学实验动物中心提供)。腹腔注射复合麻醉剂(2 ml/kg)麻醉后，经心脏先灌注生理盐水100 ml，再灌注含4%多聚甲醛0.1 mol/L PB溶液400 ml。取全脑至颈髓，放入含4%多聚甲醛0.1 mol/L PB溶液中后固定24 h，转入含30%蔗糖的0. 1 mol/L PB溶液，待标本沉底后利用Leica冰冻切片机进行全脑和颈髓横断面连续切片(2只)和正中矢状面切片(2只)，片厚40 μm，按次序每张6张切片贴于涂有明胶的载玻片上，共贴113张玻片，总计有效切片493张。
1.2 LFB染色 先将大鼠脑切片放入无水乙醇：氯仿1∶1混合溶液中8 h，然后转入95%乙醇5 min，在0.1%LFB液56 ℃过夜，再将标本移入95%乙醇溶液5 min后，转入70%乙醇3 min，此时标本呈墨绿色，灰白质尚不能分清。将标本放入双蒸水清洗3 min后置于0.05%碳酸锂溶液中分化5 min，并在70%乙醇溶液中继续分化30 s，双蒸水洗片。镜下观察至脑核团、白质边界清晰后将标本放入70%乙醇3 min，并置入0.1%焦油紫溶液复染30 s后，再次双蒸水洗片。依次用70%、90%乙醇处理标本5 min后，常规进行脱水透明(95%乙醇2次，100%乙醇3次，100%乙醇/二甲苯1次，二甲苯3次，每次5 min)，中性树胶封片。
1.3 图像的获取和处理 大鼠脑切片经染色后按顺序在Leica显微镜2.5倍物镜下观察拍摄，拍摄时按照贴片顺序由前向后依次拍摄6张切片，确保获得连续切片。由于大鼠脑片较大，在2.5倍镜下不能拍摄全貌，对每张切片进行分区拍摄，根据脑片的大小，每张切片分为2~15个部分分别拍摄，拍摄时保证每个部分的照片之间有重叠区域。所有标本拍摄焦距、光圈均保证一致。每张照片以JPG格式保存，分辨率为2272×1704像素。整个拍摄过程为15 d。
将原始照片按顺序命名并保存至同一文件夹中，共计9127张照片。利用Photoshop7.0软件将每张照片根据重叠区进行无缩放拼接，拼接后每张脑片为6265×3785像素(图1)。这样可以在Photoshop7.0中可以直接用标尺来测量脑片中结构的大小。拼接后共计得到有效脑片493张(图2)。将有效切片图像重新命名为“001.jpg”、“002.jpg”、“493.jpg”保存，并按“三轴法”进行配准：根据三维空间的“X”、“Y”、“Z”轴来定位三维空间内的结构方式，在三维重建过程中，我们依据切片图像的结构特征规定标本的这三条轴，将这三条轴延续为三个面，即“X”轴所在的冠状面，“Y”轴所在的水平面和“Z”轴所在的矢状面。冠状面，在冰冻机上切标本时已经确定，所有切片均是在同一冠状面上所切得，不需要重新定位;水平面是最复杂的面，首先要在全脑选择两个最低点作一条“底线”，这条“底线”是以桥脑的最低两点来确定，这最低的两点也作为Y轴的“0”标点，尔后选择数个高点，在Photoshop上测出高点和低点的前后距离(Y轴距)和上下距离(Z轴距)(图3)，用前后距离算出高点和低点之间的张数即Y轴距除以切片厚度得到，用Z轴距除以所得的张数，即可得出低点至该高点过程中每张切片需要下移的距离即格数，矢状面的选择可以借助两边对称法进行，在端脑部以正中裂与胼胝体中部两点确定，在间脑部则以正中裂和第三脑室来确定，在脑干部则以中后正中线与脑导水管、菱形窝中线、脊髓中央管的连线来确定。这种方法称之为三轴定位法，适用于全脑标本，主要借用脑桥低点作为Y轴定位的“0”点以及脑表面后部恒定结构和局部脑组织特殊结构作为Z轴的“0”点。在本实验中，在低点周围依据外形选择20个高点，算出每个高点与低点的距离除以片厚得到中间的张数和每张移动的Z轴距离。具体公式如下：
相邻高低点中相隔张数(Nn)=Y轴距(μm)/40 μm
相邻高低点中每张切片位移数(格数)=Z轴距(格数)/Nn(n表示相邻区序号)
1.4 三维重建 在普通PC机(Pentium4(R) 3.06G, 40 GB, 512 M)运动行3D-DOCTOR软件，按以下步骤进行重建。第一步新建“New Stack” ，将连续图片全选后导入，将其保存“0-492.lst”文件;第二步是在“Set Object”中选中“default”，利用“Boundary Editor”以及“Peicewise Boundary”手工方式对脑片外形、侧脑室、第三脑室、中脑导水管以及脊髓中央管进行描绘，颜色为红色;第三步在“Set Object”中创建一个新的描绘物，命名为“左侧锥体束”设置颜色为黄色;第四步分别在“Set Object”中创建一个新的描绘物，命名为“右侧锥体束”设置颜色为蓝色;第五步在“Current Object”中选中“左侧锥体束”、“右侧锥体束”，参照立体定位图谱利用“Boundary Editor”以及“Peicewise Boundary”手工方式对所有脑片中左侧和右侧锥体束所在部位进行描绘(图4);第六步将所描绘图像保存为“0-492.prj”;第七步设置渲染值：X、Y栏中输入“3.65”，Z栏中输入“40”，单位为“μm”;第八步对所描绘图形进行渲染，渲染方式为“Simple Rendering”和“Complex Rendering”，前者以“3ds”文件输出，后者结果以“SUF”文件输出。整个重建过程为30d。重建完毕后在“View”选项中选取“Object”，在“default”项中的“transparency”方框内选择“on”，在“左侧锥体束”和“右侧锥体束”中选择“off”以突出锥体束。点击工具栏上的测量工具对重建的锥体束进行距离、角度的数据测量，重建模型可在任意平面内从不同角度进行观察。
1.5 模型可视化 重建出的模型以.3ds文件输出后导入3DMAX8.0软件中，通过“材质编辑”、“赋予材质”、“灯光”、“动画处理”和“渲染”，将文件保存为.avi格式输出，得到大鼠脑外形和锥体束显微结构的可视化动画视频。
2 结 果
大鼠脑外形三维重建结果显示，重建模型的端脑、中脑、桥脑和延脑形态清晰逼真，各脑部之间分界明显;锥体束形态完整，自端脑运动中枢发出后经内囊行至中脑大脑脚，向下行于桥脑基底部、延脑锥体，在延脑下方交叉至对侧并行于脊髓后索(图5，见封二);可以在任意断面从不同角度观察锥体束的显微结构，并且动态显示锥体束在脑内的行径。
3 讨 论
本实验通过对大鼠全脑组织连续切片对脑和锥体束进行三维重建和可视化研究，取得了较满意的重建效果。在重建过程中，各个环节处理都能影响到重建的最终效果、精确度和科学性。本文从以下几个方面进行分析探讨。
3.1 切片的处理 首先是切片过程中的掉片、坏片、卷片以及切片数量的问题，因为是连续切片，掉片、坏片太多会影响结果的准确性，切片太厚会影响结果的精确性，太薄会发生卷片，也会造成切片数量多、处理复杂，此外，必要的染色方法则是对目标结构显示的一个关键因素。神经纤维的染色方法有很多，但适用于大批量贴片的染色方法较少，一些特异性的免疫组织化学染色方法如BDA[7]、PKC-γ[8]常采用漂片法，由于漂片处理过程长、显示差异性大，故难以应用于连续切片的三维重建。针对掉片和坏片的问题，本实验通过多次预实验对切片的厚度、切片方法进行了尝试，发现40 μm的厚度的切片发生卷片、坏片的机率较小，对神经纤维束的表现也较精细，所得切片数量比较适合于普通PC机的处理。在切片的染色方面，Luxol Fast Blue(LFB)[9]是非特异性的神经纤维染色方法，在脑片中能够清晰完整地显示较大的传导束，本课题组以往也做过LFB染色重建大鼠脊髓内皮质脊髓束，并且取得了比较满意的效果[10]，因此本实验也采用LFB对大鼠脑内锥体束进行非特异性染色。
3.2 切片的对齐和校准 切片的对齐和校准也是影响三维重建精确性和可信度的重要因素。由于组织学三维重建是建立在大量贴片的基础上，切片过程中标本的旋转、位移相差较大，以往的实验往往用参照物进行对齐和校准，一般有外(硬)参法和内(软)参法两种，外参法主要用于石蜡包埋标本[11]，在石蜡包埋标本中顺着标本长轴加入外界标记物，切片时保留这些标记物，重建时以其为标准进行，这种方法比较简单直接，效果也不错，但如果用于脑这种标本则有其弊端：首先脑内含脂类物较多，高温分解会对其外形有影响，其次脑标本形状变化较快，在贴片时要包含外参物，这就使得开始处和结尾处切片占载玻片的空间过大，空白处较多，耗费的电脑资源较多，不适用于普通PC机的处理，再者外参物一旦在加入时产生歪曲，对后面的参照工作也会产生影响;内参法可以用邻近组织相似性来对齐前片的贴片，对于小段的、形状变化不大的标本这种方法是最简单可靠的，但对于全脑的三维重建则比较局限，在形态变化明显处如延脑桥脑沟和中脑大脑脚等这些部位无法弄清下张切片应该上移或下移。还可根据特定的结构(如脊髓中央管、大脑导水管等)进行对齐，但对于全脑，没有一个特征性的结构是贯穿于全脑的，故而这种方法不适用于本实验。本实验采用的三轴定位法是基于三维物体在空间内三轴分布的特点，将物体分为三个相互垂直轴(X，Y，Z轴)，二维图片中已有两个轴，在三维数字化模型的重建过程中，要根据与二维平面相垂直的平面建立起坐标系统即定位系统对所得二维图像进行连续的对齐和校准。本实验在大鼠脑冠状切面的基础上，利用正中矢状切面对其进行对齐和校准，结果与Ourselin等运用盒定位法进行重建的结果[12]比较一致。
3.3 软件的选择 三维重建软件有多种，适用于组织学的主要有3D-slicer和3DDOCTOR两种，前者还可用于影像学三维重建[13]，一般重建软件价格昂贵，操作复杂。3D-slicer重建细节较好，精确度和可信度均高于3DDOCTOR，但软件价格也较之昂贵，对计算机硬件要求也较高，操作也较后者复杂;3DDOCTOR虽然在细节方面略逊于3D-slicer，但价格相对较便宜，对于行程较短的传导束重建的可信度和精确度也较高，且普通计算机也可运行，操作方便，在对软件重建参数进行修改后可达到较好的重建效果，本实验采用3DDOCTOR软件对大鼠脑及其内部锥体束进行三维重建和可视化，取得了比较满意的效果。
本实验通过对SD大鼠脑的连续切片、LFB染色、三轴定位系统配准、3DDOCTOR4.0软件重建和3DMAX8.0软件可视化等过程，重建出的大鼠脑外形、锥体束的显微结构与真实标本相比可信度高，效果较好，可动态显示锥体束显微结构的全貌，为神经纤维束的损伤修复研究提供精确的三维立体形态学基础。但对于神经纤维束的细节方面特别是锥体束与脑干内核团、锥体外系(红核、小脑)的联系尚需进一步研究和探讨。
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