甘珀酸对铁离子诱导的癫痫大鼠缝隙连接及脑电的影响

作者：陈伟观，高志伟，姜正林，戴珍祥，倪耀辉，宋建华 作者单位：(1南通大学附属医院康复医学科，2神经内科，3南通大学航海医学研究所，南通 226001)
【摘要】 目的：探究缝隙连接在外伤性癫痫(posttraumatic epilepsy，PTE)发病机制中的作用。方法：大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组和甘珀酸干预组。观察大鼠行为学表现，并作脑电图动态记录。结果：大鼠行为学上出现癫痫发作，脑电图描记出多种形式的癫痫样放电波形。与模型组相比，应用甘珀酸干预后，大鼠行为学发作明显减少，程度减轻，痫性放电潜伏期不同程度延长，频率明显减慢和波幅明显降低，差别具有统计学意义(P<0.05)。结论：腹腔注射甘珀酸可明显减轻痫性发作，减少痫性放电频率，降低波幅，提示大量异常的缝隙连接生成可能在PTE形成中起到了重要作用。

【关键词】 外伤性癫痫;铁离子;缝隙连接;甘珀酸;脑电图

The intervention of carbenoxolone to gap junction and the EEG of Fe3+ induced epilepsy in rat

　　CHEN Weiguan1，GAO Zhiwei2，JIANG Zhenglin3，et al (1Department of Rehabilitation Medicine, the Affiliated Hospital of Nantong University，2Department of Neurology,3Institute of Nautical Medicine，Nantong University，Nantong 226001)

　　[Abstract] Objective: To explore the role of gap junction in the posttraumatic epilepsy. Methods: Rats were divided into four groups: normal, sham operated, model and carbenoxolone intervention. Behavior of epilepsy was observed and EEG was recorded. Results: Rats displayed typical epileptic behaviors, and epileptic discharges were observed at the same time. Carbenoxolone reduced seizure degree, prolonged the latencies of epileptic discharge, and decreased frequency and amplitude of epileptic waves (P<0.05). Conclusions: Intraperitoneal administration of carbenoxolone could reduce seizure degree. Gap junction might play a role in posttraumatic epilepsy.

　　[Key words] Posttraumatic epilepsy; FeCl3; Gap junction; carbenoxolone; Electroencephalogram

　　外伤性癫痫(posttraumatic epilepsy，PTE)是一种继发于脑部创伤后，反复的痫性发作性疾病，可能出现在头部外伤后的数年[1]。它在原发损伤的基础上进一步加重了脑组织的病理损伤及神经生化改变，恶化病情，增大死亡风险，使临床处置更趋复杂，给患者带来了极大的精神负担和就业压力，同时也给家庭和社会带来了沉重的经济负担，因此这是一个巨大的医学和社会问题。目前对PTE缺乏有效的防治方法，绝大部分患者可发展为难治性癫痫，其主要原因是对PTE的发病机制尚未清楚。我们通过建立铁诱导的大鼠PTE模型，探讨缝隙连接(gap junction，GJ)阻断剂甘珀酸在PTE防治中的应用及相关机制，为GJ阻断剂用于临床治疗PTE提供必要的信息。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物与分组 健康成年雄性SD大鼠，清洁级，体重220～250 g，由南通大学实验动物中心提供。大鼠随机分为：(1) 正常组;(2) 模型组：将10 μl 0.1 mol/L的FeCl3溶液注射于大鼠左侧额叶皮质感觉运动区域;(3) 假手术组：将等量生理盐水注射于大鼠左侧额叶皮质感觉运动区域;(4) 甘珀酸干预组：造模前 30 min予甘珀酸20 mg/kg腹腔注射，此后每日腹腔注射一次甘珀酸，剂量仍为20 mg/kg，每组8只。

　　1.2 主要试剂及仪器 甘珀酸(美国Sigma公司);FeCl3(上海市金山化工厂);自凝造牙粉和自凝牙托水(上海医疗器械股份有限公司齿科材料厂);502瞬间强力胶(浙江金鹏化工股份有限公司);立体定向器(江湾Ⅰ型C，上海川沙花木农机厂);多道生理记录仪(RM-6240，成都仪器厂);微量进样器(10 μl，上海安亭微量进样器厂)。

　　1.3 模型制备 铁离子注射建立PTE大鼠模型，参照 Willmore 提出的方法[2]，并稍作改良。大鼠以10%水合氯醛溶液(350 mg/kg)腹腔麻醉后，固定于立体定向器上，常规消毒皮肤后，沿头顶正中线切开头皮，切口长约 3.0 cm。根据大鼠脑立体定位图谱[3]，在左侧颅骨冠状缝后 2.0 mm、矢状缝旁 2.0 mm处钻一个直径 2.0 mm的孔，微量进样器缓慢进针至靶点，进针深度为 2.5 mm，缓慢注射0.1 mol/L的FeCl3溶液，速率l μl/min，注射剂量为10 μl，注射后留针 10 min，以防注射入脑组织内的FeCl3溢出。另外再钻5个安放电极的孔，孔的位置分别为前囟前 2.0 mm、中线左右旁开 3.0 mm，以及前囟后 6.0 mm、中线左右旁开 2.0 mm，参考电极置于额骨正中(图1)。所有电极予自凝牙托水调和牙托粉，并加502胶水固定。最后缝合头顶皮肤，常规消毒后，将大鼠从立体定位仪上取下，观察大鼠的行为学变化，并记录大鼠脑电图。

　　1.4 痫性发作及脑电图的记录 注射过程中及随后 120 min内观察大鼠行为学表现，此后于每日上午 9点至 11点定时观察，并记录发作等级。根据经典的大鼠癫痫发作 Racine分级[4]判断大鼠是否有癫痫发作行为。评分标准：0级：无任何癫痫发作行为;1级：面部阵挛，咀嚼，哈欠;2级：1级加点头，面部抽搐，颈部肌肉抽动;3级：2级加前肢或后肢抽搐;4级：3级加后肢站立，身体突然立起;5级：4级加四肢节律性抽动，下肢强直伴全身背曲或抽动，跌倒。大鼠于制模前 30 min至造模后 120 min内分别记录大鼠的脑电变化。在制模后 24 h、 7 d及 14 d接受处理前各描记EEG 1h。当出现尖波、棘波、尖(棘)慢综合波、多棘慢综合波时判定为癫痫样脑电活动。

　　1.5 统计学方法 所有数据用x±s表示，利用Stata 10.0统计软件处理数据。两组间比较采用 t 检验，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用 q 检验，以 P<0.05 表示差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 大鼠癫痫发作的形式 大鼠注射FeCl3成功致痫后主要表现为：大鼠出现凝视、不动，呈阵发性，此后开始出现下颌快速咬动，伴有面部肌肉抽动，面肌抽搐时可见大鼠的胡须有节律地抖动，双眼眼裂变大，眼球向外凸出，整个过程持续时间约1～2 min，如此反复发作，为轻度惊厥的表现，继之出现一侧前肢震颤，或表现为“湿狗样”抖动动作，持续时间约5～10 s;继而站立、双前肢震颤及持续性点头;直至双前肢震颤加重，失去平衡跌倒而出现全身性强直-阵挛性发作;严重发作时大鼠可突然出现整个身体向后翻转360°后跳起，离地高度约10～20 cm，连续数次后摔倒在地，出现四肢剧烈抽搐，抽搐时间约0.5～1 min，之后瘫软在地，静止不动约5～10 min后恢复正常活动。致痫后大鼠可见明显的躁动不安，表现为不停地奔跑，持续时间约5～10 min。

　　2.2 大鼠癫痫发作的频率 正常组大鼠无癫痫发作行为学表现。假手术组大鼠亦未观察到任何抽搐发作表现。模型组大鼠在麻醉期间偶有身体轻微的颤抖，基本上没有自主活动，有时可见间歇性对侧头部阵挛及咀嚼;模型建立后3～8 h，大鼠开始出现癫痫发作，主要表现为咀嚼、头部阵挛、面部抽动、点头及前肢阵挛的发作，多为Racine 分级1～3级，约每4～6 h发作1次，此后逐渐增多，且发作级别呈逐天增高;5～7 d时，开始出现身体站立、双前肢震颤及跌倒发作，多为4～5级;7 d时，80%大鼠反复出现自发性的4～5级发作，但发作频率逐渐下降，平均每天发作约2～3次。同时可见，应用甘珀酸干预后，大鼠行为学发作频率明显减少，程度减轻。

　　2.3 大鼠癫痫发作的评分 图2所示为正常组、模型组、假手术组以及甘珀酸干预组大鼠每日最高发作等级评分的比较。由图可见，与模型组相比，应用甘珀酸干预后，大鼠每日最高发作程度明显减轻(P<0.05，P<0.01)。

　　2.4 脑电图变化 正常大鼠的EEG均为以低幅β、α为主要节律的基础波，散在θ波，波幅<100 μV(图3)。假手术组未见典型的癫痫样放电。模型组大鼠注射FeCl3后 60 min内，注射侧出现偶发的单个中幅尖波;此后注射侧癫痫样放电增多，EEG上出现多种形式的癫痫样放电波形(图4、5)，主要表现为波幅明显高出背景波、频率明显高于背景波的高幅棘波、棘慢波综合、尖波及尖慢波等。频率最快可达30 Hz，波幅高达270 μV以上，发作后可出现抑制波。伴随EEG上出现癫痫样放电的同时大鼠行为学上表现为身体背屈强直，四肢剧烈抽搐，双眼眼裂变大，眼球向外凸出。模型建立后 7 d、14 d时，在观察到抽搐发作的同时各导联均记录到阵发的节律性的高幅棘波、棘慢波综合和尖波，大鼠癫痫发作间期EEG上仍可见阵发的节律性的波幅明显高出背景波的高幅尖波和尖慢波。与模型组相比，甘珀酸干预组大鼠行为学、痫样放电潜伏期不同程度延长、频率明显减慢、波幅明显降低(P<0.05)，差别具有统计学意义(见表1)，同样时间痫样放电数也有减少。

　　3 讨 论

　　在癫痫的发生机制上，神经元异常同步放电成为大家所公认。GJ是目前发现的细胞间唯一能够直接进行物质信息交换的通道，它可能是神经胶质细胞-神经元信息交流的部位之一。Meister等[5]发现，2个相邻神经节细胞动作电位传递的间隔时间几乎为零，GJ的这种直接传递，被认为是促使神经元活动达到同步化的重要原因。因此，近年来备受关注，认为与癫痫的发生、特殊化异常电位的快速扩布有重要关联。此前许多研究主要是GJ阻断剂抑制或减轻癫痫发作的研究。Bostanci等[6]发现青霉素致痫后 1h给予不同剂量的甘珀酸可以抑制痫样棘波的波幅和频率，减轻行为学发作。Medina-Ceja等[7] 在4-AP致痫的大鼠模型也得到了类似的结果，并且发现在应用甘珀酸(22±4.4)min时完全阻止了痫性发作，且作用持续达 120 min。这些都支持GJ在癫痫特征性的神经元同步化发放的形成和发展过程中发挥了作用。

　　本实验建立铁离子诱导的PTE大鼠模型，同时监测大鼠EEG及行为学改变。大鼠EEG上表现出多种形式的癫痫样放电波形，行为学上也出现相应的表现。各实验组的病程明显地分为急性期、静止期和慢性期，相似于人类的PTE病程。这与以往许多研究结果相一致，从脑损伤到抽搐出现的演变过程，即癫痫的形成过程，与可扩散的棘波放电的形成相关。致痫大鼠抽搐发作的形式和特征与匹罗卡品诱发的癫痫模型及电刺激杏仁核点燃的癫痫模型的抽搐形式和特征相似。与模型组相比，甘珀酸干预组大鼠行为学、痫样放电潜伏期不同程度延长、频率明显减慢、波幅明显降低(P<0.05)，同样时间痫样放电数也有减少;同时行为学上痫性发作的评分和发作频率也较模型组显著降低(P<0.05)。

　　我们的实验由于造模前 30 min给予干预，不仅出现了甘珀酸对模型建立后对GJ的阻断作用，此外似乎还显示了造模前对GJ通道形成的干预，明显减轻了模型大鼠 24 h时行为学上痫性发作及EEG上痫样放电。Nassiri等[8]予脑室内提前30 min注射不同剂量的另一种GJ阻断剂奎宁，发现可以减轻戊四氮引起的大鼠全面强直-阵挛性发作。Samoilova等[9] 通过观察培养的大鼠海马脑片发现，甘珀酸处理 3h后明显减少了自发的和诱发的痫样放电。最近Wang等[10] 研究了缝隙连接蛋白(connexion，Cx)43表达的卵母细胞，发现Cx拟肽Gap27对于GJ的抑制作用仅出现在卵母细胞配对前提前使用Gap27;当卵母细胞建立GJ通道后再使用Gap27，则没有效果。这一结果提示Cx拟肽干扰的是GJ通道的形成。以上结果说明甘珀酸可以抑制GJ，有较明确的抗癫痫作用，其可能的作用机制是源于由甘珀酸引起的神经元间电偶联减少使神经元放电去同步化，从而预防癫痫发作。似乎提示单纯的GJ阻断剂无疑对癫痫治疗提供了新的前景。

　　有关GJ在癫痫发病机制中的作用目前尚缺乏较系统的研究，虽然已提示GJ与神经元兴奋性有关，但具体的途径和方式及其与其它与兴奋性相关基因的相互联系仍需深入研究[11] 。对于TBI患者，通过早期阻断或减少细胞间缝隙连接通讯，可以阻止异常GJ的形成或引起GJ通道的关闭，使细胞间缝隙连接通讯功能下降，从而抑制异常神经元放电从致痫区向周边及远隔部位的传递，延长痫性发作潜伏期，减少发作次数。

【参考文献】
　　[1] Agrawal A，Timothy J，Pandit L，et al.Post-traumatic epilepsy: an overview[J]. Clin Neurol Neurosurg, 2006, 108(5):433-439.

　　[2] Willmore LJ， Sypert GW，Munson JV,et al.Chronic focal epileptiform discharges induced by injection of iron into rat and cat cortex[J]. Science, 1978, 200(4349):1501-1503.

　　[3] Parinos G，Watson C. The rat brain in stereotaxic coordinates[M].Oxford(UK)：Elsevier Academic Press，2005：85-89.

　　[4] Racine RJ.Modification of seizure activity by electrical stimulation. II. Motor seizure[J]. Electroencephalogr Clin Neurophysiol, 1972, 32(3):281-294.

　　[5] Meister M,Wong RO. Baylor DA, et al.Synchronous bursts of action potentials in ganglion cells of the developing mammalian retina[J]. Science, 1991, 252(5008):939-943.

　　[6] Bostanci MO, Bagirici F.Anticonvulsive effects of carbenoxolone on penicillin-induced epileptiform activity: an in vivo study[J]. Neuropharmacology, 2007, 52(2):362-367.

　　[7] Medina-Ceja L,Cordero-Romero A, Morales-Villagran A.Antiepileptic effect of carbenoxolone on seizures induced by 4-aminopyridine: a study in the rat hippocampus and entorhinal cortex[J]. Brain Res, 2008(1187):74-81.

　　[8] Nassiri-Asl M, Zamansoltani F， Zangivand AA.The inhibitory effect of trimethylamine on the anticonvulsant activities of quinine in the pentylenetetrazole model in rats[J]. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, 2008, 32(6):1496-1500.

　　[9] Samoilova M, Wentlandt K, Adamchik Y, et al.Connexin 43 mimetic peptides inhibit spontaneous epileptiform activity in organotypic hippocampal slice cultures[J]. Exp Neurol, 2008, 210(2):762-775.

　　[10] Wang J,Ma M, Locovei S, et al.Modulation of membrane channel currents by gap junction protein mimetic peptides: size matters[J]. Am J Physiol Cell Physiol, 2007, 293(3):C1112-1119.

　　[11] Traub RD, Draguhn A, Whittington MA, et al.Axonal gap junctions between principal neurons: a novel source of network oscillations, and perhaps epileptogenesis[J]. Rev Neurosci, 2002, 13(1):1-30.