双歧杆菌在儿童口腔的分布及与儿童龋病的关系

作者：翟晶晶1 邹静2 鲁莉英3    作者单位：(1.口腔疾病研究国家重点实验室，四川大学;2.四川大学华西口腔医院 儿童口腔科，四川 成都 610041;3.中国人民解放军总医院 儿童口腔科，北京 100853)
 
【摘要】  目的 探索一种可以较好地分离口腔双歧杆菌的选择性培养基，以此为基础，检测儿童口腔不同部位双歧杆菌的分布状态，初步探讨口腔双歧杆菌与儿童龋病的发生关系。方法 选择70例3~6岁儿童为研究对象，其中无龋组30例，重症婴幼儿龋(S-ECC)组40例。无龋组收集唾液及唇面、邻面、面沟裂的混合菌斑;S-ECC组收集唾液、光滑面菌斑、牙面白垩斑菌斑和深龋龋坏组织。在经过改良的TPY选择性培养基中进行培养，提取细菌总DNA，用双歧杆菌特异性引物进行聚合酶链反应，对其电泳条带进行记录分析。结果 S-ECC组双歧杆菌的检出率为47.5%，无龋组为0，2组间检出率的差异有统计学意义(P<0.05)。在S-ECC组儿童口腔的不同部位，双歧杆菌检出率分别为唾液27.5%、光滑面菌斑27.5%、白垩斑菌斑20.0%、龋坏组织22.5%，不同检测部位间检出率的差异无统计学意义(P>0.05)。齿双歧杆菌在S-ECC组儿童口腔不同部位的检出率分别为唾液10.0%、光滑面菌斑7.5%、白垩斑菌斑7.5%、龋坏组织10.0%，不同检测部位间检出率的差异也无统计学意义(P>0.05)。结论 改良TPY双歧杆菌选择性培养基是一种适合分离口腔双歧杆菌的选择性培养基;双歧杆菌可能与S-ECC的发生相关，但其检出情况与儿童牙面的部位关系不大。

【关键词】  重症婴幼儿龋; 双歧杆菌; 齿双歧杆菌; 聚合酶链反应

Distribution of Bifidobacterium in oral cavities of children and the relations with caries ZHAI Jing-jing1, ZOU Jing2, LU Li-ying3. (1. State Key Laboratory of Oral Diseases, Sichuan University, Chengdu 610041, China; 2. Dept. of Pediatric Dentistry, West China College of Stomatology, Chengdu 610041, China; 3. Dept. of Pediatric Dentistry, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China)

　　[Abstract] Objective To explore a selected-media of Bifidobacterium from oral cavity, to detect the distribution of Bifidobacterium in different sites of children and primarily investigate the relationship between oral Bifidobacterium and early childhood caries. Methods 70 children aged from 3 to 5-year-old were selected, 30 children were caries-free and 40 were severe early childhood caries(S-ECC). Saliva was collected and plaque samples from the 30 healthy subjects were pooled. For S-ECC group, plaques were collected separately from four different sites as follows: Saliva, surfaces of intact enamel, surfaces of white spot-lesions, and deep dentin-lesions. Samples would be grown in the selected-media, and the whole DNA of bacteria was extracted. Polymerase chain reaction was performed with specific primers and the results were analyzed by the electrophoresis. Results Bifidobacterium were detected 0 in the caries-free children, while 47.5% in the S-ECC group. There was significant difference between two groups(P<0.05) and there was no difference between different sites of teeth in S-ECC group(P>0.05). 27.5% Bifidobacteriumwere detected in saliva, 27.5% on surfaces of intact enamel, 20.0% on surfaces of white spot-lesions and 22.5% in deep dentin-lesions. 10% Bifidobacterium dentium were detected in saliva, 7.5% on surfaces of intact enamel, 7.5%on surfaces of white spot-lesions and 10.0% in deep dentin-lesions. Conclusion One type of modified selected media of Bifidobacterium in oral cavity was explored. Bifidobacterium may be related to the occurrence of the S-ECC andhas nothing to do with different sites of teeth in children.

　　[Key words] severe early childhood caries; Bifidobacterium; Bifidobacterium dentium; polymerase chain reaction

　　龋病是儿童最常见的一种口腔疾病。引起龋齿发生的因素很多，其中细菌因素是主要因素[1]。儿童龋病最主要的致病菌为变异链球菌和乳杆菌[2]，近年来有研究表明，双歧杆菌(Bifidobacterium)也可能是儿童深龋的致病菌之一[3]。双歧杆菌是口腔常驻菌，它与龋病的关系已逐渐被关注。双歧杆菌属是一群具有多形态、无动力的革兰阳性无芽孢厌氧菌，该菌属首先从婴儿粪便中分离得到，主要包括青春双歧杆菌、分叉双歧杆菌、栖牙双歧杆菌、齿双歧杆菌(Bifidobacterium dentium，Bi.dentium)和殊形双歧杆菌等[4]。双歧杆菌对机体具有重要的生理作用，被称为人体益生菌(probiotic)，目前被大量添加在儿童饮品中。该菌属在人类口腔的分布尚不完全清楚，已分离到的主要为齿双歧杆菌、栖牙双歧杆菌和殊形双歧杆菌[5]。目前关于双歧杆菌与口腔疾病的相关研究较少，与儿童龋关系的研究就更少;而且尚未发现较好的分离人类口腔双歧杆菌的选择性培养基[6]，也限制了对该菌的研究。本研究在实验中探索出一种对口腔双歧杆菌选择性较好的培养基，并采用聚合酶链反应(polymerase chain re-action，PCR)技术检测患有重症婴幼儿龋(severe earlychildhood caries，S-ECC)和无龋儿童乳牙不同部位菌斑的双歧杆菌定植情况，初步探讨口腔双歧杆菌与儿童龋的相关关系，为生态防龋提供依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 研究对象

　　随机选取40例2008年4月至9月期间就诊于四川大学华西口腔医院儿童口腔科的3~6岁患儿为试验组，其中女18例，男22例，平均年龄4.4岁。纳入标准：诊断为S-ECC的初诊儿童，1个月内未服用抗生素，无全身系统性疾病及其他口腔疾病。S-ECC诊断标准为[7]：3岁患儿的龋失补牙面数(decayed，missing or filled surfaces，dmfs)≥4，4岁患儿的dmfs≥5，5岁以上患儿的dmfs≥6。排除标准：口腔龋齿未达到S-ECC的诊断标准，1个月内服用过抗生素，全身抵抗力低下或患有系统性疾病。另外随机抽取四川省成都市武候区棕北金苹果幼儿园30例3～6岁无龋儿童作为对照组，其中女14例，男16例，平均年龄4.7岁。对照组要求检查前1个月内未服用抗生素，无系统性疾病和先天性疾病。试验前向2组儿童的父母说明实验目的和过程，并签署知情同意书。

　　1.2 双歧杆菌选择性培养基的制作及部分试剂

　　经过多次筛选，本试验采用经过改良的TPY双歧杆菌选择性培养基培养双歧杆菌。在青岛高科园海博生物技术有限公司提供的TPY双歧杆菌选择性培养基的基础上，室温下在每100 mL培养基加入氯化锂0.3 g、山梨酸0.04 g、丙酸钠1 g，pH值调整为6.5(25 ℃)，高温灭菌后再加入卡那霉素100 μg·mL-1、硫酸新霉素200 μg·mL-1。采用全基因组DNA提取试剂盒(上海捷瑞生物工程有限公司)提取细菌DNA，用于PCR的特异性引物由大连宝生物工程有限公司合成。

　　1.3 菌斑标本的收集

　　样本收集前要求患儿用清水漱口1 min，然后用无菌牙签收集菌斑标本。对照组(无龋组)儿童收集唾液和混合菌斑，菌斑样本至少取3个牙面(包括唇面、邻面和面);试验组(S-ECC组)儿童分别取唾液、光滑面菌斑、牙面白垩斑菌斑及深龋龋坏组织。菌斑收集后，各自分装于预先经过消毒灭菌、装有转送液的EP管中(其中S-ECC组龋齿样本中预先放置玻璃珠)，1 h内送到实验室完成接种。

　　1.4 细菌的接种和分离

　　将转送的样本混匀，在无菌操作台上各取15 μL接种于改良过的选择性培养基，接种后放置厌氧培养箱专性厌氧培养48~72 h。挑选特征性菌落做革兰染色、耐氧实验和Rogosa培养基的鉴别培养，将选择出的细菌进行纯化培养、生化试验和DNA鉴定。为避免遗漏，将一部分样本接种后的第2代混合细菌直接提取DNA，其后用双歧杆菌的特异性引物进行种属鉴定。

　　1.5 双歧杆菌特异性引物及细菌通用引物的设计根据Genebank上双歧杆菌的16S rRNA基因序列[3]、参考文献重复率较高的引物及引物合成公司(大连宝生物工程有限公司)的建议设计本试验所用引物的基因序列，分别设计了细菌的通用引物、双歧杆菌属特异性引物[8]和齿双歧杆菌特异性引物[9]。本试验引物序列及预计扩增长度见表1。

　　1.6 细菌DNA的提取及PCR反应

　　将备用的细菌离心，收集沉淀，按照细菌DNA提取试剂盒的要求提取总DNA，-70 ℃保存。PCR反应体系的总体积为25 μL，其中Tag酶12.5 μL，10 μm·L-1上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，去离子水9.5 μL。混匀后离心5 s。PCR反应条件：95 ℃预变性2 min，然后95 ℃变性30 s，56.7 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环，72 ℃最终延伸5 min。PCR扩增产物在质量分数为1.5%琼脂糖凝胶和Tris硼酸盐乙二胺四乙酸(Tris/borate/ethylenediaminotetraacetic acid，TBE)缓冲液中电泳30 min，电压220 V。采用Bio-Rad凝胶成像系统观察并记录电泳条带。

　　1.7 统计分析

　　用SPSS 10.0统计软件对S-ECC组和无龋组儿童菌斑中双歧杆菌的检出率进行2个率比较的卡方检验分析，对S-ECC组儿童不同部位的双歧杆菌检出率进行行乘列表的卡方检验分析。检验水准为双侧α=0.05。

　　2 结果

　　经细菌的分离培养、生化鉴定及PCR鉴定，2组儿童的双歧杆菌检出率见表2，同一儿童不同部位的双歧杆菌和齿双歧杆菌的检出率见表3。由表2可见，40例S-ECC组儿童中有19例检出双歧杆菌，30例无龋组儿童均未检出双歧杆菌(表2)，2组检出率的差异有统计学意义(P<0.05)。由表3可见，儿童口腔不同部位的双歧杆菌检出率的差异无统计学意义，齿双歧杆菌在不同部位检出率的差异也无统计学意义(P>0.05)。对PCR产物电泳图进行分析，结果显示：所有样本均有细菌通用引物的PCR产物表达;检出双歧杆菌的样本既有细菌通用引物的表达，又有双歧杆菌通用引物的表达(图1);检出齿双歧杆菌的样本，既有上述2种通用引物的表达，又有齿双歧杆菌特异性引物的表达(图2)。M：DNA Marker;S：唾液;W：白垩斑菌斑;D：龋坏组织;1：双歧杆菌通用引物;2：细菌通用引物。

　　3 讨论

　　菌斑细菌在龋病发病中占有重要地位。根据生态菌斑学说，儿童龋的发生并不是单一致龋菌的作用，而是口腔生态平衡失调导致由变异链球菌、乳杆菌、放线菌、韦荣菌、奈瑟菌等口腔常驻菌共同作用的结果[10]。本研究结果显示，30例无龋儿童均未检出双歧杆菌，40例S-ECC儿童有19例检出双歧杆菌，检出率为47.5%。双歧杆菌在不同部位的检出率分别为：唾液27.5%，光滑面菌斑27.5%，白垩斑菌斑20.0%，深龋龋坏组织22.5%;齿双歧杆菌在不同部位的检出率分别为：唾液10.0%，光滑面菌斑7.5%，白垩斑菌斑7.5%，深龋龋坏组织10.0%。由此可见，双歧杆菌在S-ECC儿童龋齿发生的不同阶段均有检出，推测其存在和口腔环境有关，并伴随龋齿发生发展的全过程;齿双歧杆菌的检出情况也证明其为口腔双歧杆菌的活跃菌种[11]。本试验进行的PCR鉴定结果显示：S1、W1、D1为不同部位样本与双歧杆菌通用引物扩增的PCR产物;S2、W2、D2为其与细菌通用引物扩增的PCR产物(图1);所有样本均有细菌通用引物的扩增产物，但只有定植着双歧杆菌的样本才有其特异性表达。在口腔双歧杆菌中，齿双歧杆菌最早被检出，其性状也最为活跃，S3、W3、D3为其PCR扩增产物的特异性表达(图2)。Becker等[3]的研究表明，S-ECC儿童的双歧杆菌检出率可达70%，并推测它可能是深龋的主要致龋菌。本研究中，龋坏组织检测到双歧杆菌者占22.5%，说明双歧杆菌确实可在深龋组织中检出，但此结果比Becker等[3]的检出率低，可能与取样、培养、人种等因素有关。本研究结果还显示出S-ECC组和无龋组的双歧杆菌的检出情况明显不同。S-ECC组的不同部位均可检出双歧杆菌，且其检出率无明显差异，说明S-ECC儿童的口腔状态有利于双歧杆菌的生存。该结果提示，S-ECC儿童存在口腔微生态环境失衡，在此条件下，双歧杆菌成为条件致病菌，龋损环境有利于双歧杆菌的生长。传统的细菌培养、生化鉴定等方法费时且不稳定，但有助于研究细菌特性;分子生物学方法简便快速，但存在较高的假阳性。本试验将二者结合起来，互补不足，为研究细菌的致病机制奠定基础。口腔内细菌种类繁多，目前尚无一种较好的分离口腔双歧杆菌的选择性培养基[6]。笔者在试验初始阶段，通过对培养基成分的改良和反复筛选，摸索出一种可以较好地分离口腔双歧杆菌的选择性培养基。笔者在原成品双歧杆菌选择性培养基的基础上，加入氯化锂、山梨酸、丙酸钠，它们均有抑制细菌和真菌生长的作用[6，12]，从而为双歧杆菌的分离提供了条件;还加入硫酸新霉素和卡那霉素，二者均为双歧杆菌耐受的抗生素[6]，且容易获得、保存方便。本试验证明，经过改良的双歧杆菌选择性培养基对该菌的选择性较好。当分离样本中含有双歧杆菌时，双歧杆菌的生长较好;而样本中不含双歧杆菌时，少量的其他细菌可在其上生长，如乳杆菌、放线菌等。由此可见，本研究所用培养基对双歧杆菌的分离和挑选提供了很大方便，可推荐作为口腔双歧杆菌的选择性培养基。但该培养基也存在一定的不足之处，如不能抑制乳杆菌、放线菌等口腔常驻菌的生长，对于其他可能混杂的细菌未能进行进一步的种类划分和鉴定。因此，对双歧杆菌的特异性选择培养基还需作进一步的探索。

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