过敏性紫癜病儿急性期免疫细胞功能变化

作者：柏翠，宗金宝，张秋业    作者单位：青岛大学医学院附属医院，山东 青岛 266003 儿科；免疫检验科
 
【摘要】  　　目的 探讨过敏性紫癜（HSP）病儿急性期免疫细胞功能变化及其意义。方法 以53例HSP急性期病儿为研究对象，并根据有无尿检异常分为肾炎（HSPN）组和非肾炎（NHSPN）组，以30例正常儿童作为对照组。采用流式细胞术检测3组外周血CD3+细胞、CD4+细胞、CD8+细胞、CD4+/CD8+比值、CD4+CD25+细胞、NK细胞（CD16+CD56+）和B淋巴细胞（CD19+）水平。结果 HSPN组和NHSPN组外周血CD3+细胞、CD4+细胞、CD4+/CD8+比值、CD4+CD25+ 细胞和NK细胞水平较对照组显著降低，CD8+细胞和B淋巴细胞水平较对照组显著增高(F=6.80～46.40，q=2.81～4.25,P<0.01、0.05)，而HSPN组和NHSPN组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。HSP病儿CD4+CD25+细胞水平与CD4+细胞、CD4+/CD8+比值呈正相关(r=0.369、0.285,P<0.01、0.05)，与CD19+细胞呈负相关(r=-0.279,P<0.05)，而与CD8+细胞和CD16+CD56+细胞无相关性(r=0.009、-0.104,P>0.05)。结论 HSP病儿急性期存在免疫细胞功能异常，T细胞亚群紊乱，CD4+CD25+T细胞和NK细胞数量降低，导致B细胞呈多克隆活化，在HSP发病机制中具有重要作用。

【关键词】  紫癜,过敏性　儿童　免疫,细胞　流式细胞术

　　FUNCTIONAL CHANGES OF IMMUNE CELLS IN CHILDREN WITH HENOCHSCHONLEIN PURPURA IN ACUTE STAGEBAI CUI,

　　ZONG JINBAO, ZHANG QIUYE

　　 (Department of  Pediatrics, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China);

　　［ABSTRACT］ Objective To investigate the functional changes of immune cells in children with HenochSchonlein Purpura（HSP） in acute stage and their significance. Methods Fiftythree children with HSP were involved in this study, who were divided into HenochSchonleinPurpuranephritis (HSPN) group and nonHSPN (NHSPN) based on whether the urine analysis was normal or not. Thirty healthy children were served as control. Flow cytometry was applied to detect the amounts of CD3+ cells, CD4+ cells and CD8+ cells, CD4+ /CD8+ ratio, and the levels of CD4+CD25+ cells, NK cells (CD16+CD56+) and B cells (CD19+) in peripheral blood.  Results The amounts of CD3+ cells, CD4+ cells, CD4+CD25+ cells, NK cells and the ratio of CD4+/CD8+ in the HSP and NHSPN children were significantly lower than those in the control children, while CD8+ cells and B cells were significantly higher (F=6.80-46.40;q=2.81-4.25;P<0.01,0.05). The differences between those in HSP and theNHSPN children were not significant (P>0.05). The amount of CD4+CD25+ cells of the HSP was positively correlated with that of CD4+ cells and CD4+/CD8+ ratio (r=0.369,P<0.01;r=0.285,P<0.05), and negatively correlated with tthat of CD19+ cells (r=-0.279,P<0.05), but not correlated with those of CD8+ cells and CD16+CD56+ cells (r=0.009,-0.104;P>0.05).Conclusion Children with HSP in acute stage have a disordered cellmediated immunity, which mainly manifests as derangement of Tcell subsets, decrease of  CD4+CD25+ T cells and NK cells, resulting in polyclonal Bcell activities, which plays an important role in the pathogenesis of this condition.
   
　　［KEY WORDS］ purpura, SchoenleinHenoch; child; immunity, cell; flow cytometry
   
　　过敏性紫癜(HSP)是儿童时期常见的血管炎性疾病，以广泛的小血管炎症为病理基础，肾脏损害是其常见表现和并发症，其病因和发病机制尚未完全明确。近年来的研究结果表明，HSP病儿存在免疫调节功能紊乱[1]。本文采用流式细胞术(FCM)检测HSP急性期病儿外周血T淋巴细胞及亚群（包括CD3+细胞、CD4+细胞、CD8+细胞、CD4+CD25+细胞)、B淋巴细胞(CD19+)和NK细胞（自然杀伤细胞，CD16+CD56+）水平变化，进一步探讨HSP发病机制。现将结果报告如下。

　　1  资料与方法

　　1.1  一般资料

　　1.1.1  HSP组

　　选取2008年1月—2009年4月在我院儿内科住院的HSP急性期病儿53例，男31例，女22例，年龄2～12岁，平均8.65岁，均符合《诸福棠实用儿科学》HSP的诊断标准。依据有无尿检异常[血尿和（或）蛋白尿]将HSP组病儿分为肾炎（HSPN）组和非肾炎（NHSPN）组。肾炎组18例，男10例，女8例，年龄3～12岁，平均7.33岁；非肾炎组35例，男21例，女14例，年龄2～12岁，平均9.97岁。采血前均未接受糖皮质激素或免疫调节剂治疗。

　　1.1.2  对照组

　　选取同期我院儿童保健门诊健康体检儿童30例，男16例，女14例，年龄1～12岁，平均8.30岁，均无近期感染及个人或家庭过敏史、系统性疾病史。

　　1.2  检测方法
   
　　采用直接免疫荧光标记全血溶血方法，在流式细胞仪(美国Coulter公司)上测定外周血CD3+、CD4+、CD8+、CD4+CD25+、CD19+、CD16+CD56+细胞数，并计算CD4+/CD8+比值。取肝素抗凝外周血100 μL, 分别加CD3FITC/CD16+56PEz、CD4FITC/CD8PE、CD3FITC/CD19PE、CD4FITC/CD25PE及FITC/PE Mouse IgG1双标记荧光抗体20 μL(抗体均购于法国Immunotech公司),混匀，室温避光孵育20 min，然后加入红细胞裂解液1 mL，混匀，室温避光孵育20 min，用PBS洗涤2次后上机检测。

　　1.3  统计学处理
   
　　应用SPSS 17.0及PPMS 1.5[2]统计软件进行统计处理。实验数据呈正态分布，以±s表示。各组间比较采用单因素方差分析及q检验，两变量间相关分析采用直线相关分析法。

　　2  结果

　　2.1  HSP病儿急性期外周血淋巴细胞及其亚群水平变化
   
　　HSPN组和NHSPN组病儿外周血CD3+细胞、CD4+细胞、CD4+/CD8+细胞比值、CD4+CD25+ 细胞、CD16+CD56+细胞水平较对照组显著降低，CD8+细胞、CD19+细胞水平较对照组显著增高(F=6.80～46.40，q=2.81～4.25,P<0.01、0.05)，而HSPN组和NHSPN组间淋巴细胞及其亚群比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。表1  各组外周血淋巴细胞及其亚群检测结果比较(略)

　　2.2  HSP病儿CD4+CD25+细胞计数与其他淋巴细胞水平变化的相关性
   
　　HSP病儿CD4+CD25+细胞水平与CD4+细胞、CD4+/CD8+比值呈正相关(r=0.369、0.285,P<0.01、0.05)，与CD19+细胞水平呈负相关(r=-0.279,P<0.05)，而与CD8+细胞和CD16+CD56+细胞则无相关性(r=0.009、-0.104,P>0.05)。

　　3  讨论

　　HSP是一种主要累及毛细血管的变态反应性疾病，以非血小板减少性紫癜、关节炎或关节痛、腹痛、胃肠道出血及肾炎为主要临床表现，其中肾损害的严重程度直接影响到该病的预后。其发病机制尚不完全清楚。多数研究表明，HSP与免疫调节功能紊乱有关。在免疫应答过程中，CD4与CD8淋巴细胞起着十分重要的调节作用。在正常情况下，CD4和CD8相互诱导，相互制约形成T细胞网络，从而调节正常免疫功能和维持免疫的自稳性。本文结果显示，HSPN组和NHSPN组急性期病儿CD3+细胞、CD4+细胞、CD4+/CD8+比值显著降低，CD8+细胞明显升高，与WIERCINSKI等[3]报道结果相符，表明HSP病儿存在细胞免疫功能失调，主要表现为辅助T淋巴细胞(CD4+)数量降低，效应T淋巴细胞(CD8+)数量增高，CD4+/CD8+比值下降。但有研究指出，HSP病儿急性期T细胞亚群变化与HSP是否并发早发性肾损害无明显相关性[4]。本文结果亦显示，HSP病儿急性期B淋巴细胞（CD19+）显著升高，而NK细胞（CD16+CD56+）显著下降。CD19是成熟B淋巴细胞特异性标志，CD19显著升高，说明B淋巴细胞活化增殖增多，体液免疫反应增强。有研究指出，病毒或细菌感染和动物性食物蛋白过敏是HSP最主要诱因[5]，在抗原物质刺激下可使B细胞数量增加。B细胞增殖与Th2细胞功能亢进有关，研究发现HSP病儿Th2类细胞因子如IL4和IL6显著增高，Thl类细胞因子如IL2水平降低[67]。结合本实验结果，考虑B细胞增高与T细胞亚群紊乱及其分泌的细胞因子异常有关。CD16+CD56+是鉴别NK细胞的特征性标志。NK细胞是一类重要的免疫调节细胞，对T细胞、B细胞等均有调节作用。本研究结果与有关文献报道一致[8]。NK细胞的降低对B淋巴细胞增长分化的抑制力减弱，导致B淋巴细胞数量及活性升高，分泌免疫球蛋白增加，参与免疫复合物形成而引起毛细血管壁的损伤[9]。本文结果显示，HSPN组与NHSPN组相比较外周血CD3+细胞、CD4+细胞、CD8+细胞、CD4+/CD8+比值、CD4+CD25+细胞、NK细胞和B淋巴细胞水平差异均无显著性，提示HSP急性期有无肾脏损害病儿间外周血淋巴细胞数量变化并无差异。齐鲁医学杂志2010年4月第25卷第２期  Med J Qilu, April 2010, Vol.25, No.２
   
　　调节性T淋巴细胞（Tregs）是T淋巴细胞的重要亚群，依据其产生部位和生成方式分为自然产生的Tregs和适应性Tregs，CD4+CD25+T细胞即自然产生的Tregs，是机体内Tregs的主要类型,占人外周血CD4+T细胞总数的5%～10%。CD4+CD25+ Tregs具有免疫无能和免疫抑制两大功能特征，主要通过细胞接触机制抑制CD4+细胞、CD8+细胞的免疫反应[10]。越来越多的证据表明，CD4+CD25+ Tregs在抑制自身反应T细胞的活化和增殖方面起着不可或缺的作用。去除CD4+CD25+ Tregs的动物会出现各种自身免疫病如甲状腺炎、胃炎、结肠炎和1型糖尿病，而重新被动输注正常的CD4+CD25+ Tregs可预防这些疾病的发生[11]。此外，CD4+CD25+ Tregs对肿瘤免疫、微生物免疫、抑制变态反应以及骨髓移植排异反应均有重要的调控作用。本研究结果显示，HSP病儿急性期CD4+CD25+细胞显著下降，与有关文献报道一致[1213]。HSP病儿CD4+CD25+细胞与CD4+细胞、CD4+/CD8+比值呈正相关，而与CD19+细胞呈负相关，提示CD4+CD25+ Tregs异常在HSP的发病机制中具有重要的意义。其机制可能涉及以下几个方面。①CD4+CD25+ Tregs表面表达的CD25、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA4)、膜性TGFβ等与效应T细胞接触后,抑制T细胞生长因子IL2的基因表达,抑制抗原特异性CD4+及CD8+T细胞增生,或使其转变为无能或反应低下的T细胞,使机体产生免疫耐受[1415]。当该类细胞减少或功能降低时,免疫耐受平衡破坏,机体接受抗原刺激后,发生变态反应,产生免疫复合物沉积, 则可能引起HSP。②CD4+CD25+ Tregs使专职抗原提呈细胞(APC)表面的协同刺激分子减少,抗原提呈功能减弱,不能有效激发特异或非特异性免疫应答[16]。当CD4+CD25+ Tregs减少或功能降低时,APC抗原提呈功能增强,使机体对变应原发生超敏反应。③CD4+CD25+ Tregs可产生较多抑制性细胞因子IL10, IL10在体内外能调节抗原特异性B细胞,调节抗体类别转换,抑制变态反应。当该细胞数量或功能降低时, IL10减少,则可能发生变态反应性疾病。
   
　　综上所述，HSP病儿急性期存在免疫细胞功能异常，主要表现为T细胞亚群紊乱（CD4+/CD8+比值降低）、CD4+CD25+T细胞和NK细胞数量降低，导致B细胞呈多克隆活化，在HSP发病机制中具有重要作用，提示免疫调节疗法在HSP治疗中有重要价值。

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