RASSF1A基因在肝细胞肝癌中的表达及其临床意义

作者：梅海军，咸 华    作者单位：(南通大学附属医院小儿外科，南通226001)
【摘要】  目的：探讨RASSF1A基因在肝细胞肝癌(简称肝癌)组织中的表达情况并探讨其临床意义。方法：采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测48例肝癌组织及癌旁正常组织RASSF1A基因的转录水平。结果：48例肝癌组织中有32例RASSF1A mRNA表达缺失;但48例相应癌旁组织仅有16例RASSF1A mRNA表达缺失。logistic逐步回归分析表明患者的年龄、性别、肝功能、血AFP、肝癌分化、肝癌大小、肝癌有无包膜与RASSF1A mRNA是否表达无显著相关性(P>0.05)。但在HBsAg(+)患者的肝癌组织及相应的癌旁组织中RASSF1A mRNA的表达率显著低于HBsAg(-)患者(P<0.01,P<0.05)。结论：RASSF1A表达缺失在肝癌的发生、发展中起重要的作用。

【关键词】  基因表达;肝细胞肝癌;RASSF1A;递传家一聚合酶链反应

Expression and clinical significance of RASSF1A gene in hepatocellular carcinoma

　　MEI Haijun,XIAN Hua (Department of Pediatric Surgery, the Affiliated Hospital of Nantong University, Nantong226001)

　　[Abstract] Objective：To study the expression of RASSF1A gene in hepatocellular carcinoma (HCC) tissues and to investigate its clinical roles.Methods：Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) was used to detect the mRNA expression of RASSF1A in the tumor samples, non-cancerous liver samples, all obtained during operation, from 48 HCC patients. Results：No expression of RASSF1A in HCC was observed in 32 of 48 cases; in contrast, RASSF1A was expressed in 32 of 48 non-cancerous liver samples. Using the multivariable, unconditional logistic regression model. There were no statistically significant correlations between RASSF1A expression status and age, sex, hepatocirrhosis, liver function, AFP serum, tumor size, differentiation, and envelope (both in tumor and corresponding non-cancerous tissues). The loss of RASSF1A expression was more frequent in patients who were HBsAg(+) compared to those who were HBsAg(-) both in tumor (P<0.01) and corresponding non-cancerous tissues (P<0.05). Conclusion：Loss of RASSF1A mRNA expression may play an important role in oncogenesis and development of HCC.

　　[Key words] Gene expression; Hepatocellular carcinoma; RASSF1A;Reverse transcription-polymerase chain reactionRASSF1A (Ras association domain family 1 A)基因是2000年从人类3号染色体短臂21.3位点 (3p21.3)上克隆出来的新型抑癌基因[1]。该基因在肝细胞肝癌(以下简称肝癌)组织中的表达及其与临床相关因素关系的研究报道较少，本研究应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测48例肝癌组织与癌旁组织中RASSF1A mRNA的表达情况，并结合临床资料进行比较分析。

　　1 材料与方法

　　1.1 标本来源 48例肝癌标本来自于2005 年10 月～2006 年12月本院手术切除的未进行过放、化疗的肝癌病例。分别收集肝癌和癌旁组织(肝癌组织为肝癌活性组织，不含坏死组织和正常肝组织;癌旁组织为切除标本距离肝癌最远(>2 cm) 的肝组织，其中对照组正常肝组织来源于肝血管瘤切除时的周边正常肝组织)，标本收集后立即置于液氮中保存。所有病例均经组织病理学检查确诊，肝癌分化标准依照Edmondson四级分法(高分化组，为G1期;中分化组, 为G2和G3期;低分化组，为G4期)。

　　1.2 RT-PCR Trizol RNA抽提试剂购自Gibco公司;所用引物及PCR相关试剂均为上海申友生物公司产品;RNA逆转录酶SuperScript Ⅱreverse transcriptase购自 Clothe公司。Trizol法收集肝癌标本的总RNA，逆转录反应使用随机引物OligdT18合成第一链(严格按照厂家说明书进行)。PCR引物序列为：RASSF1A,上游: 5'–GATGAAGCCTGTGTAAGAACCGTCCT–3'，下游: 5'–CAGATTGCAAGTTCACCTGCCACTA–3'，产物大小为245 bp;内参照β-actin，上游5'-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3'，下游5'- CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3'，产物大小为300 bp。RT-PCR产物10 μl在2 %的琼脂糖凝胶上电泳分离。

　　1.3 统计学方法 各组间率的差异比较采用χ2检验，logistic回归分析RASSF1A表达缺失的情况与各临床相关因素的数量关系。所有结果经Stata 7.0统计软件包进行统计学处理，P<0.05表示差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 组织总RNA鉴定 经Trizol提取组织总RNA后，测定A*/A*比值应≥1.8，说明无蛋白污染。经1%琼脂糖电泳鉴定，见总RNA有清晰的28S和18S两条条带，表明RNA无降解，无DNA污染(结果未显示)。

　　2.2 RASSF1A mRNA在肝癌标本的表达情况 48例肝癌组织中有32例RASSF1A mRNA表达缺失;但48例相应癌旁组织仅有16例RASSF1A mRNA表达缺失。RASSF1A mRNA在肝癌组织中和癌旁组织中的表达缺失率差异有统计学意义(P<0.05)。对照组正常肝脏组织标本均有RASSF1A mRNA表达(图1)。

　　2.3 RASSF1A mRNA的表达与肝癌临床相关因素的关系 Lgistic回归分析显示，RASSF1A mRNA的表达与患者的年龄、性别、肝功能情况、血AFP、肝癌分化、肝癌大小、肝癌有无包膜无明显相关性(P>0.05);显检测格子的构成比差异，并不直接反映因素之间的关系：还是用Logistic回归分析。但RASSF1A mRNA的表达缺失率与肝癌患者是否有肝硬化及乙肝表面抗原(HBsAg)是否阳性显著相关(P<0.05)：合并有肝硬化或HBsAg(+)患者的肝癌组织和相应癌旁组织中RASSF1A mRNA的表达率显著低于没有肝硬化或HBsAg(-)患者。另外, RASSF1A mRNA的表达率在合并有远处转移的肝癌组织中更高(P<0.05)。将各临床相关因素引入logistic回归分析模型, 在多因素水平下筛选影响RASSF1A表达缺失的相关临床因素，结果表明患者的年龄、性别、肝功能、血AFP、肝癌分化、肝癌大小、肝癌有无包膜与RASSF1A mRNA是否表达无显著相关性(P>0.05)。但在HBsAg(+)患者的肝癌组织(P <0.01)及相应的癌旁组织(P <0.05)中RASSF1A mRNA的表达率显著低于HBsAg(-)患者。

　　3 讨 论

　　RASSF1A基因是RASSF1基因家族中的一员。其cDNA序列中含有6个外显子，全长1873 bp，编码由340个氨基酸组成的、分子量为38.8 kD的蛋白多肽，因其肽链组成C末端的氨基酸组成顺序与小鼠Ras效应蛋白Nore1/Maxp1的氨基酸组成顺序有高度同源性(>55%)而得名。在对肺癌、大肠癌、肾癌等研究中发现，RASSFIA在几乎所有的正常组织中表达，而在肺癌等肿瘤组织中存在较高的表达缺失率[3]。我们研究发现，RASSFI A mRNA在48例肝癌组织中的表达缺失率高达66.7%(32/48)，而在相应的癌旁组织中仅为33.3%(16/48)，提示RASSFIA的表达缺失在肝癌的发生过程中可能发挥重要作用。我们还发现，RASSFlA mRNA的表达缺失与是否合并乙肝有关，合并有HBsAg(+)患者的肝癌组织中RASSFIA mRNA表达缺失率显著高于HBsAg(-)患者。提示RASSFlA mRNA表达缺失可能是乙肝引起肝癌的机制之一[4]。

　　RASSF1A基因作为抑癌基因的作用机制尚未完全明确。研究表明RASSF1A基因不仅可以通过增强丝氨酸-苏氨酸激酶Mst1(mammalian Sterile20-like 1)的活化，促进由死亡受体信号通路诱导的细胞凋亡;还能直接与Bax结合蛋白MOAP-1相互作用，诱导Bax活化，经线粒体通路诱导细胞凋亡。CNK1也需与RASSF1A-Mst1 复合物相互作用后才具有促凋亡功能。RASSF1A基因的可通过下调cyclinD1、cyclinA2表达水平和上调非p53调控的p21*表达水平诱导肿瘤细胞周期阻滞， 也可通过抑制JNK(c-Jun-NH2-kinase)磷酸化来阻断JNK通路来抑制肺癌细胞的生长。RASSF1A含有一个与微管结合的区域，与微管相结合后可促进微管稳定性，调节细胞有丝分裂的进程。Macheiner等发现Nore1B需与RASSF1A相互作用才具有抑制肝癌细胞生长的功能。目前，RASSFIA基因与肝癌发生、发展中的作用机制的研究还处于初级阶段，其确切机制还有待于进一步的研究。

【参考文献】
  　[1] Dammann R, Li C, Yoon JH, et al.Epigenetic inactivation of a Ras association domain family protein from the lung tumour suppressor locus 3p21.3[J]. Nat Genet,2000, 25(3):315-319.

　　[2] Pfeifer GP, Dammann R. Methylation of the tumor suppressor gene RASSF1A in human tumors. Biochemistry (Moscow) 2005, 70(5): 576-583.

　　[3] 葛东峰，姚运红.RASSFIA基因在肿瘤发生发展中的作用[J].实用癌和杂志，2009，24(1)：98-100，103.

　　[4] 周业庭，吴柏华，刘伟平等.RASSFIA基因在肝癌组织中的表达其临床意义[J].中华实验外科杂志，2007，24(10)：1198-1199.

　　[5] Donninger H, Vos MD, Clark GJ. The RASSF1A tumor suppressor. J Cell Sci 2007，120(pt 18): 3163-3172.