缺血后处理对犬肺移植术后早期炎症反应的影响

作者：鲁建军， 姚 达， 秦存伟， 张 伟， 罗红鹤， 钟佛添， 巫国勇    作者单位：(中山大学附属第一医院胸外科， 广东 广州 510080)
【摘要】  【目的】 观察供体犬肺再灌注后早期炎症因子及脂质过氧化反应的变化情况，了解缺血后处理对供体犬肺植入后功能的影响。 【方法】 12对比格犬，随机分成两组，对照组：6对犬，进行供受体左侧异体单肺移植，不予缺血后处理的干预，按常规方式进行;缺血后处理组：6对犬，进行供受体左侧异体单肺移植，常规方式获取的供体犬肺植入后，再灌注早期实施3个周期的10 s再灌和10 s再阻断，总时程1 min的缺血后处理。于供体犬肺再灌注后1 h和2 h时间点采集供肺标本，采用考马斯亮兰法检测超氧化物歧化酶(SOD)的活性、丙二醛(MDA)的含量;采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测供体犬肺植入后1、2 h时间点受体左房混合静脉血IL-8水平的变化;关于光镜下观察供体犬肺植入后1、2 h时间点肺组织的病理变化。采用重复测量资料的方差分析进行检验。 【结果】 手术无1例失败，均存活。供体肺脏植入时间平均(35.9 ± 1.7) min。缺血后处理组在1 h、2 h时间点的供体肺组织SOD活性水平较对照组升高(P < 0.001);而供体肺组织MDA含量较对照组减低(P < 0.001)。缺血后处理组的左房混合静脉血的血浆IL-8水平在1、2 h时间点均较对照组的明显减少(P < 0.05)。缺血后处理组肺组织光镜下观察在各时间点的炎症反应均较对照组的变化轻微。【结论】 缺血后处理可能通过减少供体肺组织再灌注后细胞因子IL-8的分泌，从而减轻缺血再灌注后的炎症反应性损伤，达到改善供体犬肺的植入后的功能。

【关键词】  肺移植; 缺血后处理; 缺血再灌注损伤; 白细胞介素-8; 脂质过氧化反应

　Influence of Ischemic Postconditioning on Inflammatory Reaction

　　after Lung Transplantation in Canine

　　LU Jian-jun， YAO Da， QIN Cun-wei， ZHANG Wei， LUO Hong-he， ZHONG Fo-tian， WU Guo-yong*

　　(Department of Chest Surgery， The First Affiliated Hospital， Sun Yat-sen University， Guangzhou 510080， China)

　　Abstract： 【Objective】 To study the influence of ischemic postconditioning on the lung function of the donor through measuring the change of inflammatory factor and lipid perioxidation reaction in the early time of reperfusion. 【Methods】 Twelve cases of the orthotopic left lung transplantation were performed using 24 canines， which were random divided into the ischemic postconditioning group and the contrast group averagely. Before the reperfusion of lung donors in the canines of the ischemic postconditioning group， the ischemia post-conditioning protocol was performed： 10 s reperfusion with 10 s blockade afterwards， for 3 cycles. The canines in the contrast group， without intervention of postconditioning， were processed normally. The MDA contents and SOD activity in the pulmonary tissues of donors were detected by Commassie Brilliant Blue at 1 or 2 hour after transplantation， respectively. The serum inteleukin-8 contents were detected by enzyme linked immunoadsorption assay， meanwhile， the freshly-obtained pulmonary specimens at different time points were employed the HE staining. 【Results】 Transplants were completed in 12 canines， the mean time for anastomoses was (35.9 ± 1.7) min. The SOD activity was significantly higher than that of experimental group at 1or 2 hour after transplantation(P < 0.001). The MDA contents of experimental group was significantly lower than that of control group(P < 0.001) at 1 or 2 hour after transplantation. There is significant difference in the serum inteleukin-8 contents of recipient at 1 ～ 2 h after donor implanted (P < 0.05). Under the light microscopic examination， the changes of pathologic inflammation in the ischemic postconditioning group were less than that of the contrast group. 【Conclusion】 Ischemic postconditioning could reduce the ischemic reperfusion injury through restraining the lung tissue to secrete inteleukin-8.

　　Key words： lung transplantation; ischemic postconditioning; ischemic reperfusion injury; inteleukin-8; lipid perioxidation reaction

　　[J SUN Yat-sen Univ(Med Sci)，2009，30(5)：547-550]

　　肺脏移植是终末期肺病的标准治疗方法[1]，肺脏移植不可避免的遇到供体肺脏缺血再灌注损伤的问题。由于对缺血再灌注损伤的机制不断深入的研究，人们认识到，肺缺血再灌注后，大量的中性粒细胞聚集、浸润，从而加重再灌注的肺组织的损伤[2]。缺血后处理是针对缺血再灌注损伤而引发的效应，是机体强有力的内源性保护现象。本实验观察缺血后处理减少供肺的缺血再灌注损伤的情况，观察供体犬肺再灌注后早期血浆白细胞介素(IL)-8水平及脂质过氧化的变化，了解缺血后处理对供体犬肺植入后功能的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 分组与处理

　　成年比格犬24只(中山大学动物中心提供)，体质量(13.2 ± 2.6) kg，雌雄不限，供受体一一配对，体质量匹配在 ± 20% 之内。随机分成两组：①对照组6对犬，进行供受体左侧异体单肺移植，不予缺血后处理的干预，按常规方式进行。②缺血后处理组6对犬，进行供受体左侧异体单肺移植，常规方式获取的供体犬肺植入后，再灌注早期实施3个周期的10 s再灌和10 s再阻断，总时程1 min的缺血后处理。

　　1.2 实验模型的建立

　　经胫后静脉注射戊巴比妥钠(30 mg/kg)，麻醉动物。平稳后，仰卧于特制的手术台上，固定。行气道插管，呼吸机维持通气：吸入体积分数100%的氧，潮气量10 ～ 15 mL/kg，呼吸频率20 min-1，吸气与呼气比为1：1.5 ～ 2，呼气末正压为0.49 kPa;游离右侧股动、静脉，用压力传感器分别监测体循环压力和中心静脉压;穿刺股静脉，维持静脉输液(4 mL·kg-1·h-1)。将动脉血氧饱和度传感器套于犬舌末端，用心电监护仪持续监测[3]。

　　1.3 供体犬肺的获取

　　正中胸骨入路，左心耳处全身肝素化(注射肝素钠3 mg/kg)。经右室流出道插8F气囊导尿管至左肺动脉主干，建立灌注管道。导尿管气囊充气阻断左肺动脉，进行灌注，同时切开左心耳减压左心，灌注液采用0 ～ 4 ℃ LPD液(40 mL/kg + 肝素1 mg/kg)，灌注压维持在20 ～ 30 mmHg(1 mmHg = 0.133 kPa)，速度30 mL·min-1·kg-1，灌注时间 6 ～ 8 min。同时两侧胸腔浇灌冷盐水，此时肺仍进行通气;灌注至肺呈灰白色。一旦达到器官灌注满意和降温要求，退气管插管，中度膨胀肺，高位钳夹和切断气管，心脏及双肺联合切取。切取后供肺继续轻度膨胀，心肺块放在0 ～ 4 ℃冷盐水盆内。修剪左侧肺，保留与左肺静脉各支相连的左房袖，较长的左肺总动脉及适当长的左总支气管，待做肺移植用。

　　1.4 受体犬肺的处理和供肺的植入

　　犬上半身右侧卧位，下半身仰卧位固定于手术台。于第4肋间进胸，切除左全肺，尽可能的保留长的左肺动脉残断和左主支气管。左心耳注入肝素钠1 mg/kg，供体左侧犬肺冷保存4 h后，植入受体左侧胸腔，按如下顺序吻合支气管及血管：先完成供体左总支气管与受体左总支气管吻合;在进行供体左肺总动脉与受体左肺总动脉;最后行供体左房袖与受体左心耳吻合。

　　1.5 观察指标

　　于供体犬肺植入后1 h、2 h时间点取约1 cm × 1 cm大小组织块，置入液氮灌内保存，实验完毕，转入 -80 ℃ 冰箱保存备用。采用考马斯亮兰法[4]测定肺组织中超氧化物歧化酶(SOD)的活性和丙二醛(MDA)的含量。血浆IL-8的检测：供体犬肺植入再灌注后1、2 h各抽1次受体左肺混合静脉血2 mL，EDTA抗凝，2 000 r/min离心(离心半径r = 6.5 cm)至血浆，置于 -80 ℃ 保存。用酶联免疫吸附法(ELISA)检测(美国ADL goat anti-canine Interleukin-8 Elisa测定试剂盒)，操作按照说明书同批进行。供体犬肺组织标本的光镜观察：供体犬肺植入再灌注后1、2 h各取0.5 cm × 0.5 cm新鲜组织块，以40 mL/L甲醛液含气浸泡固定24 h，浸蜡制片，肺组织切片(厚度4 ?滋m)常规行HE染色。

　　1.6 统计方法

　　采用SPSS 13.0，根据数据的特点，选用重复测量资料的方差分析进行时间点与两组有无差异的检验。α设为0.05。

　　2 结 果

　　2.1 手术结果

　　进行犬同种异体左侧单肺移植实验12例，手术成功12例，无失败。吻合口通畅，无扭曲，移植肺膨胀良好。12例术后2 h脱离呼吸机，均存活。移植物冷缺血时间4 h，肺灌注到摘取需时约6 ～ 8 min，供受体动静脉和支气管套管吻合需时间平均(35.9 ± 1.7) min。

　　2.2 供体植入再灌注后肺组织光镜观察

　　再灌注后1、2 h，对照组的肺组织标本的HE染色光镜下观察肺间质有轻度的渗出，部分肺泡腔可见少量纤维素性渗出，脏层胸膜轻度水肿渗出，肺间质无明显炎性细胞浸润;这些改变较缺血后处理组明显(图1)。

　　2.3 供体植入再灌注后1 h和2 h时间点供体犬肺组织SOD和MDA的变化

　　再灌注后1 h、2 h时间点两组SOD活性的检验结果P < 0.001，显示缺血后处理组在1 h、2 h时间点的供体肺组织SOD活性水平较对照组升高(表1)。再灌注后1 h、2 h时间点两组MDA含量的检验结果P < 0.001，显示缺血后处理组在1 h、2 h时间点的供体肺组织MDA含量较对照组减低(表2)。

　　2.4 供体植入再灌注后血浆IL-8的水平

　　供体植入再灌注后1、2 h，重复测量资料的方差分析，结果时间与IL-8没有交互作用，各时间点没有差异。缺血后处理组的左房混合静脉血的血浆细胞因子IL-8水平较对照组的明显减少，差异有统计学意义(P = 0.014 < 0.05，表3)。

　　3 讨 论

　　缺血再灌注(Ischemia/Reperfusion， I/R)损伤在临床上是一个非常常见的现象，具体到肺的I/R损伤亦可在多种临床情况下发生，如肺血管栓塞再通、心肺转流、肺移植以及需暂时阻断一侧肺动脉同期行血管成形术的中央型肺癌手术等[5]。近年来，随着心脏手术、器官移植、心肺脑复苏措施的深入开展，体外循环技术在临床上应用的日益增多，有关肺缺血再灌注损伤及其所导致的术后肺功能障碍的发生和防治也逐渐被人们重视。而肺I/R损伤被证实是肺移植术后早期肺功能障碍的主要原因之一，而在术后15%的一年死亡率中也是主要原因之一[6]。近10年来，医学界对肺缺血再灌注损伤发生机制的研究主要集中在以下5个方面：①氧自由基及脂质过氧化反应;②PMN(中性粒细胞)大量浸润引起的过度的炎症反应;③细胞内的钙稳态失调;④参与肺缺血再灌注损伤体液因子的作用;⑤细胞凋亡。很明显，中性粒细胞参与了缺血再灌注损伤。中性粒细胞通过粘附于内皮细胞阻塞毛细血管而导致血循环重建后的“无再流”现象，使缺血区再次缺氧，加重损伤[7]。IL-8是一种可由多种细胞产生的小分子量多肽，可趋化和激活中性粒细胞，并参与中性粒细胞与内皮细胞粘附过程的调节[8]。IL-8的生物学特征包括调节中性粒细胞特异的化学毒性作用，增强中性粒细胞游走能力，趋化中性粒细胞与内皮细胞粘附，产生呼吸爆发，造成器官功能障碍[9]。实验表明[10]，IL-8有显著的中性粒细胞趋化作用，能导致胞浆游离钙离子浓度迅速而短暂的升高，并诱导和趋化中性粒细胞变形、脱颗粒、呼吸爆发和溶酶体酶释放，使中性粒细胞得以激活。动物及人皮内注射IL-8，可导致持久的血浆渗出和大量的中性粒细胞浸润。

　　缺血后处理(Ischemic postconditioning，I-postC)是机体针对缺血再灌注损伤的一种内源性保护机制[11]。本实验通过检测再灌注后供体肺组织SOD活性和MDA含量的变化，来证实I-postC的保护作用。同时测定细胞因子IL-8的变化，从而在另一角度反映I-postC的保护作用的机制。实验结果显示：缺血后处理组在1 h、2 h时间点的供体肺组织SOD活性水平较对照组升高(P < 0.001);而供体肺组织MDA含量较对照组减低(P < 0.001)。同时，缺血后处理组的左房混合静脉血的血浆细胞因子IL-8水平较对照组的明显减少;缺血后处理组的2 h时间点的IL-8水平较1 h时间点的明显减少，而对照组的显示升高，可能是因经缺血后处理措施后，影响了IL-8水平表达的曲线分布，表达高峰的改变所致。可见缺血后处理可以减少肺组织细胞分泌IL-8，从而减少缺血再灌注后的炎症反应继发的再灌注组织损伤，因此缺血后处理可以改善供体肺脏植入后的功能。同时作者观察了再灌注后1、2 h时间点供体肺组织的病理改变，对照组的肺组织标本的HE染色光镜下观察肺间质有轻度的渗出，部分肺泡腔可见少量纤维素性渗出，脏层胸膜轻度水肿渗出，肺间质无明显炎性细胞浸润：这些改变较缺血后处理组明显。

　　近年来，许多研究表明细胞因子与缺血再灌注损伤存在密切联系，其直接或间接影响到肺移植后急性或慢性排斥反应的发生，影响肺移植的预后[12]。由于缺血后处理的可预测性及临床可控性，使其具有更广泛的临床应用范围和实用价值。I-postC特有的细胞保护机制的阐明，将为I/R防治提供新的思路和方法。

【参考文献】
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　　3 鲁建军，姚 达，马 毅，等. 犬同种异体左侧单肺移植模型的建立 [J]. 中华实验外科杂志，2007，24(11)：1436-1438.

　　4 Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding [J]. Anal Biochem， 1976，5(72)：248-254.

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