鼻咽癌中EB病毒启动子Qp的突变及其功能学研究

作者：黄宇帆1， 廖奕佶1， 刘文举1， 花文峰1， 邓海霞1， 买世娟1?鄢， 谢 丹1， 宗永生2    作者单位：(华南肿瘤学国家重点实验室∥中山大学肿瘤防治中心 1. 实验研究部; 2. 病理科， 广东 广州 510060)
【摘要】  【目的】 探讨鼻咽癌细胞中启动EB病毒核抗原1(EBNA1蛋白)表达的EB病毒Q启动子(Qp)的变异特征，比较有第62 225位点(g→a)和第62 422位点(g→c)两个点突变的Qp与原型Qp(B95.8型)的功能学差异及其生物学意义。【方法】 采用PCR的方法扩增29例鼻咽癌组织石蜡标本和14例健康成人外周血标本(总共43例)中的Qp序列，PCR产物测序后分析其突变情况，统计学分析Qp中的点突变与鼻咽癌的相关性。把突变型和原型Qp分别克隆到荧光素酶报告基因载体上，检测相对光强度(RLU)，比较突变型与原型Qp启动转录的活性。使用染色质免疫共沉淀(ChIP)实验来比较突变型和原型Qp与Sp1蛋白的亲和力。 【结果】 通过PCR扩增和测序实验，证实Qp的突变与鼻咽癌有密切的相关性(P = 0.0395，< 0.05)。突变型Qp启动转录的活性明显高于原型(RLU之比约为2.5：1，P < 0.05)，并且突变型Qp与Sp1的亲和力较原型Qp增强约1.52倍。【结论】 在鼻咽癌组织中，突变型Qp可能通过增强与Sp1亲和力的机制，使其启动转录的活性明显增强。Qp特定位点的突变在EB病毒对鼻咽上皮细胞的感染和转化过程中可能起了重要的作用。

【关键词】  鼻咽癌; EB病毒; EB病毒核抗原1; 变异型; 启动子

Variation and Functional Study of Q Promotor of Epstein-Barr Virus

　　in Nasopharyngeal Carcinoma

　　HUANG Yu-fan1， LIAO Yi-ji1， LIU Wen-ju1， HUA Wen-feng1， DENG Hai-xia1，

　　MAI Shi-juan1， XIE Dan1， ZONG Yong-sheng2

　　(1. Departmentof Experimental Research， 2. Department of Pathology， State Key Laboratory of Oncology in Southern China

　　∥Cancer Center， Sun Yat-sen University， Guangzhou 510060， China)

　　Abstract： 【Objective】 To investigate the variation of Q promoter (Qp) in nasopharyngeal carcinoma (NPC) cells， and to compare the existing two mutant sites [62 225 site(g→a)and 62 422 site (g→c) ] Qp in NPC cells with the Qp in B95.8 cell line in the functional and biological difference. 【Methods】 The Qp sequence was amplified in the samples from 29 cases of paraffin-embedded tissues of NPC suffers and 14 cases of peripheral blood of healthy adults by polymerase chain reaction (PCR) method (totally 43 cases). The point mutations on specified sites were analyzed and statistically compared from sequencing results. The sequences of variant and prototype Qp were amplified by PCR and cloned into luciferase reporter vector (pGL3-basic)， then transfected into HaCat cells respectively. The transcriptional activity was compared between variant and prototype Qp using luciferase reporter system. The DNA binding affinity of mutant and prototype Qp to Sp1 was compared through chromatin immunoprecipitation (ChIP) method since mutation of nt 62 225 located in a Sp1 binding site. 【Results】 The mutation rate of Qp was significantly higher in NPC compared with healthy controls (P = 0.039 5， < 0.05)， which suggested the variant Qp was closely associated with NPC. The transcription of the luciferase gene promoted by variant Qp was significant more than that of prototype Qp in transient transfection assay (2.5：1， P < 0.05). The binding affinity of variant Qp to Sp1 was about 1.52 times higher than that of prototype Qp as determined by quantitative ChIP assay. 【Conclusions】 The transcriptional activity was enhanced in variant Qp in NPC cells compared with prototype， which possibly through the higher binding affinity to Sp1. We suggest that the mutated Qp may play an important role during the EBV infection and transformation of nasopharyngeal epithelium.

　　Key words： nasopharyngeal neoplasm; Epstein-Barr virus; Epstein-Barr virus nuclear antigen 1; variant; promoter

　　[J SUN Yat-sen Univ(Med Sci)，2010，31(1)：23-27]

　　鼻咽癌是中国南部省份和东南亚其它地区高发病率的肿瘤之一，其发生发展可能与基因易感性、环境危险因素、特定饮食习惯和EB病毒(Epstein-Barr Virus，EBV)感染及突变[1]等因素有关。EB病毒在肿瘤细胞中以潜伏感染的形式存在，其基因组在每个细胞周期中复制一次并保持稳定的拷贝数[2-4]。EB病毒核抗原1(Epstein-Barr viral nuclear antigen 1， EBNA1)不仅是EB病毒基因组复制和维持拷贝数稳定所必须的，而且是调节自身表达所必须的[5]。EBNA1的表达在鼻咽癌中是由Qp启动[6]，因此该启动子与鼻咽癌可能存在直接或间接的联系。目前，国内外尚未见关于突变型Qp与鼻咽癌相关的报道，并且也未见突变型Qp的功能学及机制等问题的报道。本研究中，我们从鼻咽癌组织与健康人外周血标本的DNA中用PCR方法分别扩增出Qp序列并测序，结果发现与B95.8原型相比，鼻咽癌中Qp启动子有两个位点常发生点突变，即：62 225位点g→a突变，62 422位点g→c突变，而且在病例与健康人标本中的突变率有明显差异。

　　1 材料和方法

　　1.1 材 料

　　1.1.1 细胞株 永生化的人表皮细胞来源的HaCat细胞，购自中山大学实验动物中心。B95.8细胞和鼻咽癌细胞株C666-1由本实验室收藏。

　　1.1.2 主要试剂 pGL3-basic载体、T4连接酶、双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自Promega公司;DH5-?琢感受态细菌，核酸内切酶BglⅡ和 HindⅢ、rTaq酶、LATaq酶，pyrobestTaq酶(高保真)、DNAmate(核酸共沉剂)、PCR引物合成、DNAmarker：1 500 bp Ladder购自Takara公司;质粒小提试剂盒，质粒大提试剂盒，凝胶回收试剂盒、石蜡标本DNA抽提试剂盒购自QIAGEN公司;胎牛血清和RPMI-1640培养基购自Hyclone公司;优化无血清培养基Opti-mem和转染试剂Lipofectamine2000购自Invitrogen公司;其它常用实验耗材购自BD公司。ChIP实验试剂盒(cat#17-295)和Sp1抗体(cat#07-645)购自美国Upstate公司。广东鼻咽癌患者的石蜡标本来自中山大学附属肿瘤防治中心病理科，对照组的外周血标本来自广东省的EB病毒健康携带者。

　　1.2 方 法

　　1.2.1 细胞培养 HaCat细胞、B95.8细胞和C666-1细胞用含100 mL/L胎牛血清的RPMI-1640培养液，在37 ℃、体积分数5% CO2的培养箱内饱和湿度培养。

　　1.2.2 DNA抽提 使用QAIGEN公司的DNA抽提试剂盒，按照试剂盒操作手册抽提鼻咽癌石蜡标本、健康成人外周血标本、C666-1细胞及B95.8细胞的DNA，并测定DNA的浓度及纯度。

　　1.2.3 引物设计 扩增Qp序列的上游引物5′端加入Bgl Ⅱ酶切位点：Qp-S：5′tcAGATCT tataacgcaggtcctg3′， 下游引物的5′端加入HindⅢ酶切位点：Qp-A：5′cgcAAGCTTtgtaaggatagcatg 3′，PCR产物全长294 bp。 扩增的Q启动子序列长277 bp(nt 62 203 ～ 62 479)，包括了Qp中-219 ～ +58的区域。染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation，ChIP)实验所用引物为ChIP-S1：(5′ tataacgcaggtcctgttccg 3′)和ChIP-A1(5′ actttcgttttcgcaaagcg 3′)，PCR产物长215 bp，包括了Q启动子上两个Sp1结合位点。

　　1.2.4 PCR扩增和测序 使用rTaq酶分别扩增来自鼻咽癌石蜡标本和健康成人外周血标本的DNA，采用20 μL的体系，94 ℃ 2 min，反应循环94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40 circles，72 ℃ 10 min，4 ℃停止;PCR产物经琼脂糖电泳鉴定后送广州英俊生物公司双向测序。

　　1.2.5 荧光素酶报告基因载体的构建及鉴定 使用pyrobest高保真酶(Takara公司)和Qp-S、Qp-A引物分别扩增提取自C666-1和B95.8细胞的DNA，PCR产物经琼脂糖电泳并切胶回收和纯化后，经两次酶切(BglⅡ和 HindⅢ)后分别同已经相同酶切并纯化后的pGL3-basic载体片段混合，在T4连接酶的作用下4℃过夜，第2天转化DH5-?琢感受态菌，涂布含100 ?滋g/mL amp的半固态LB平板。第2天挑克隆用PCR法初步鉴定，将PCR鉴定为阳性的克隆加入6 mL LB中37 ℃摇菌过夜，质粒小提后取2 ?滋g进行BglⅡ和HindⅢ酶切鉴定，阳性质粒送广州英俊生物公司测序鉴定，得到正确的重组克隆：pGL3-basic-pQp(来自B95.8)和pGL3-basic-vQp(来自C666-1)，用质粒大提试剂盒大量抽提pGL3-basic、pGL3-basic-pQp和pGL3-basic-vQp用于后续的实验。

　　1.2.6 荧光素酶活性检测试验 HaCat细胞以1 × 105个/孔的密度接种于24孔板中，第2天生长至90% ～ 95%融合时进行转染。每孔同时转染两种质粒，0.4 ?滋g的pGL3-basic或pGL3-basic-pQp 或pGL3-basic-vQp重组质粒，以及10 ng 的pRL-TK载体(Promega 公司)。 双荧光素酶活性检测按照双荧光素酶报告基因分析系统(Promega 公司) 操作手册进行。转染48 h 后， 1 × PBS 液洗涤细胞2次，每孔加入100 μL PLB 裂解细胞。取20 μL 裂解上清加入50 μL ARII， 混匀后立即在单管式化学发光分析仪(SIRIUS Luminometer V3.1)上检测Firefly 荧光素酶活性(F值)， 再加入1 × Stop&Glo溶液50 ?滋L 检测Renilla 荧光素酶的活性(R值)。以Firefly 活性与Renilla 活性的比值即相对光强度(relative light units， RLU)表示各组转录活性。计算各组F/R 值。

　　1.2.7 染色质免疫共沉淀实验 将HaCat细胞以1 × 106个/皿的密度接种于10 cm培养皿中，第2天生长至90% ～ 95%融合时进行转染。每皿分别转染12 ?滋g的pGL3-basic-pQp 或pGL3-basic-vQp 重组质粒， 培养48 h，10 g/L的甲醛固定10 min，冰冷的PBS洗涤2次后刮下细胞，收集入EP管中。实验按照ChIP试剂盒(UpState公司：cat#17-295)操作手册进行。甲醛固定，超声裂解 (优化后的条件：12 Khmz， 5 s， once)，抗体沉淀，尼龙球沉淀，洗脱，DNA纯化，PCR扩增;其中“pQp + 抗体”和“vQp + 抗体”均加10 ?滋g Sp1抗体(购自Upstate公司： cat#07-645)沉淀，“pQp”和“vQp”未加Sp1抗体沉淀(作为阴性对照);每个样品纯化得到的DNA均溶解于30 μL的超纯水中，将作为后续PCR反应的模板。使用rTaq酶扩ChIP沉淀产物，采用20 μL的体系，94 ℃ 2 min，反应循环94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，28 circles，72 ℃ 10 min，4 ℃停止。PCR产物上样及电泳：“pQp + anti”、 “pQp”、 “vQp + anti” 和“vQp”各取7 μL上样，而对应的input各取2.5 μL上样;在 3%的琼脂糖中于0.5 × 的TBE Buffer中120 V电压下电泳30 min，采用凝胶成像仪采集图片(见图3)。补充实验：Sp1抗体经Western blotting 证实HaCat细胞中只存在一条特异结合带。

　　2 结 果

　　2.1 鼻咽癌石蜡标本和健康成人外周血标本DNA的PCR产物测序结果

　　由图1可见，与B95.8型相比，来自C666-1细胞的Qp发生了第62 225位点g→a突变和第62 422位点g→c突变。本实验中我们随机选取29例鼻咽癌石蜡标本和14例健康成人外周血标本，提取DNA扩增Qp序列，PCR产物测序结果发现，在鼻咽癌组中两个位点都突变的有18例、两位点都未突变有9例、单位点突变2例，健康成人组两位点都突变的有4例、两位点都未突变的有8例、单位点突变2例。采用SAS8.1统计软件进行病例对照的?字2 (chi-square)检验，鼻咽癌标本组中两个位点都发生突变的概率明显高于健康人组(P=0.039 5)，提示了62 225位点(g→a)和62 422位点(g→c)点突变与鼻咽癌有密切的相关性。

　　2.2 报告基因重组质粒转染HaCat细胞后荧光素酶检测试验

　　将pGL3-basic或pGL3-basic-pQp 或pGL3-basic-vQp 重组质粒以及内参照pRL-TK 共转染HaCat细胞，报告基因相对荧光素酶活性F/R 值结果显示， 与pGL3-basic 空载体(0.028 ± 0.004) 相比， 转染pGL3-basic-pQp (0.742 ± 0.065)和pGL3-basic-vQp(1.893 ± 0.277)重组质粒的两组细胞荧光素酶活性均明显增强(P < 0.05， t检验)，提示pQp和vQp两种启动子均有启动转录的活性。以pGL3-basic空载体的转录活性为基准(设为1)， pGL3-basic-pQp 和pGL3-basic-vQp 质粒相应启动转录的活性分别为26.7 ± 2.3 和68.1 ± 9.8;并且pGL3-basic-vQp 质粒启动转录的活性又明显高于pGL3-basic-pQp 质粒组(P<0.05， t 检验)，提示62 225位点(g→a)和62 422位点(g→c)有突变的Qp启动转录的活性与原型相比明显增强(图2)。

　　2.3 染色质免疫共沉淀实验

　　根据文献报道，Qp上有两个Sp1结合位点，而第62225位点正位于其中一个Sp1结合位点上。因此，为了探究突变型Qp启动转录的活性增强的机制，我们采用染色质免疫共沉淀来检测突变型Qp与细胞Sp1的亲和力是否改变。本实验的结果(图3)显示：Qp能与HaCat 细胞中的Sp1蛋白特异地结合，见图3中ChIP-P1引物组的泳道1和3均分别扩出了各自的目的带;用Quantity One 4.62软件做灰度分析，图3中泳道3目的带的灰度比泳道1增强了1.52倍，提示了vQp与Sp1的亲和力比pQp明显增强。

　　3 讨 论

　　3.1 突变型Qp与鼻咽癌的相关性研究

　　本研究通过PCR的方法分别扩增了鼻咽癌石蜡组织标本和健康成人外周血标本中的EB病毒Qp序列并进行测序，研究分析发现Qp的突变与鼻咽癌存在密切的相关性。在鼻咽癌中常可检出Qp上第62 225位点(g→a)和第62 422位点(g→c)的点突变，其中第62 225位核苷酸位于Qp上的一个Sp1结合位点内， 第62 422位点是Qp的转录起始位点;统计结果发现突变型Qp与鼻咽癌存在相关性(P = 0.039 5， < 0.05)，提示了EB病毒 Qp的突变在鼻咽癌的发生发展过程中可能起了一定的作用。

　　3.2 突变型Qp可能会上调EBNA1的表达

　　EBNA1是唯一在每个鼻咽癌细胞中均有表达的EB病毒潜伏期蛋白，对于维持EB病毒的稳定感染有重要的作用。在鼻咽癌中，EBNA1的表达由Qp启动[7]。我们克隆了原型和突变型Qp并重组到荧光素酶报告质粒pGL3-basic上，通过检测相对荧光素酶活性，发现突变型Qp启动转录的活性与原型相比明显增强。这提示突变型Qp有可能通过上调EBNA1蛋白的表达来促进病毒在鼻咽上皮细胞中的稳定感染，从而有助于鼻咽癌的发生发展进程。

　　3.3 突变型Qp增强了与Sp1的亲和力可能是其上调EBNA1表达的机制

　　与细胞管家基因的启动子相似，Qp的TATA序列含量少，主要靠富含CpG序列的启动元件发挥作用，其活性受普遍存在的细胞转录因子Sp1的调控[7-9]，Qp的CpG岛通过与不受甲基化影响的细胞因子(如Sp1等)结合来使自身处于未甲基化状态[10]。CpG序列在EB病毒基因表达调控中起非常重要的作用，甲基化状态是其表达调控的机制之一[11]。Qp内CpG序列的低甲基化与Qp的持续活性存在较强的相关性;并且通过将Qp内CpG序列甲基化的实验发现Qp的活性明显受到抑制，从而揭示出CpG序列的低甲基化状态是保持Qp活性所必须的[7]。Qp内存在两个Sp1结合位点[7]，当这些位点与Sp1结合后就会阻止邻近的序列被甲基化[12-13]。本研究发现在鼻咽癌标本中，第一个Sp1位点存在g→a的点突变，因此，为了进一步研究突变型Qp启动转录的活性增强的机制，我们进行染色质免疫共沉淀实验来探究突变型Qp与Sp1蛋白亲和力是否改变，结果发现突变型Qp与Sp1蛋白的亲和力明显强于原型。这部分解释了本研究中突变型Qp启动转录的活性增强的原因;即突变Qp与Sp1的亲和力增强，其CpG岛更多地处于未甲基化状态，于是就具有更强的启动转录的活性。因此具有更强启动转录活性的突变型Qp能更有效地启动EBNA1的表达，使含该突变型Qp的EB病毒的潜伏感染状态更加稳定，从而促进了EB病毒的转化过程。

　　综上所述，我们的研究发现在鼻咽癌细胞中EB病毒的Q启动子存在有两个位点的碱基突变，其中第一个位点的突变使Qp与Sp1的结合力增强，并可能通过降低Qp的甲基化水平使Qp的转录活性增强，促进EBNA1等病毒蛋白的表达，从而有助于EB病毒在鼻咽上皮的潜伏感染。另外，鼻咽癌中EB病毒 Qp上的第二个突变位点(第62 422位点，g→c)是Qp的转录起始位点，这个突变是否能引起Qp转录起始位点的改变或其它功能的改变，以及其在EB病毒感染和鼻咽癌发病中的意义还需要进一步研究。

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