慢性高原病患者骨髓间充质干细胞的体外扩增及鉴定
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作者：冀林华 孙 静 王红心 崔 森 李占全 作者单位：(青海大学附属医院血液科) 【关键词】 慢性高原病 细胞培养 间充质干细胞 生物学特性 INVITROAMPLIFICATION AND IDENTIFICATION OFBONE MARROW MESENCHYMAL STEM CELLS DERIVED FROM PATIENTS WITH CHRONIC MOUNTAIN SICKNESS Ji Linhua, Sun Jing, Wang Hongxin, Cui Sen, Li Zhanquan, Ge Rili ( Department of Hematology, Qinghai University Affiliated Hospital) Abstract Objective To explore the in vitro culture approaches, biological functions and biological molecular characteristics of bone marrow mesenchymal stem cells(MSCs) derived from patients with chronic mountain sickness(CMS). Methods The CMS was diagnosed by the Qinghai CMS Score established by the VI World Congress in 2004.MSCs were separated from bone marrow of 15 CMS patients(CMS group) and 15 healthy adults(control group) after their agreement by density gradient centrifugation and adherent culture in vitro. MSCs were identified according to morphology and cell surface antigen profile. The morphological changes and the proliferation growth curves of MSCs were observed in primary and passage cultures. The surface makers were detected by flow Cytometry(FCM).Results MSCs were successfully isolated from 15 CMS patients and controls. Adherent cells were spindle shape in morphology. It was found that MSCs expressed CD29,CD105 and CD13 in flow Cytometry, but did not express CD45,CD4,CD8,CD14,CD3,CD34,HLADR and CD20.CMSMSCs shared a similar morphologic characteristics and immune phenotypes with MSCs derived from normal bone marrow. The proliferation rate of MSCs in the CMS group was higher than that in the control group (P<0.01), but the passage rate was lower than that in the control group (P<0.05).It was found that the growth curve of the passage 3 cells that the growth of MSCs derived from CMS patients was more active than that of MSCs derived from the controls. Conclusion The bone marrow MSCs of CMS patients can be cultured purely and can extensively proliferate. And they possess specialbiological characteristics. Key words Chronic mountain sickness Cell culture Mesenchymal stem cell Biological characteristics 慢性高原病(chronic mountain sickness，CMS)是高原低压缺氧环境引起的一类高原特发性疾病，随海拔增高其发病率呈增高趋势。经多年研究，对红细胞增殖相关机制有了比较清楚的认识，但对CMS尚存很多问题有待进一步阐明。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一群主要存在于骨髓中的非造血细胞，在体外不同的诱导条件下可分化为多种细胞。除具有多向分化潜能外，MSCs还表达多种造血细胞因子，又能分化为支持造血的骨髓基质细胞，且与造血干细胞的归巢密切相关，具有强大的支持造血及免疫调节等功能，具有广泛的临床应用价值[1]。目前对CMS患者的MSC相关研究未见报道，故在此我们探讨CMS患者骨髓MSCs的体外培养方法、生物功能及分子生物学特征。以期进一步深化对CMS发病机制的研究。 1 资料与方法 1.1 病例资料 选择15例就诊于青海大学附属医院血液科的CMS患者(CMS组)。患者均为男性，年龄32～45岁，诊断符合第六届国际高原大会2004年制订的青海诊断标准[2]。15例对照组骨髓来源于血象和骨髓象正常的外伤性骨折患者的肋骨骨髓，选自青海大学附属医院骨科患者，本组患者均为男性，年龄24～48岁。两组间性别、年龄差异无统计学意义。 1.2 实验方法 1.2.1 骨髓MSC的分离培养：无菌条件下以CMS患者髂后上嵴为穿刺部位，抽取骨髓液5 mL(以肝素钠抗凝)，以等体积低糖DMEM稀释;对照组在无菌条件下将肋骨髓腔以低糖DMEM冲洗后收集骨髓液。稀释后的骨髓用密度为1.073 g/mL的Percoll分离液(Pharmacia公司)分离单个核细胞，DMEM洗涤2次，悬浮于含10%胎牛血清(FBS,Hyclon,美国)的DMEM/F12培养液(Gibco公司)中，采用直接贴壁法，以含10%胎牛血清的DMEM/F12作为培养液，即hMSCs培养液(mesencult medium,stem cell Tech公司)。25 cm2塑料培养瓶(Costar)接种5×106个单个核细胞，置于37℃、5%CO2的饱和湿度细胞培养箱内培养。72 h后弃掉未贴壁细胞，更换培养液，以后每 3～4 d换液1次，待细胞生长达90%融合时，用0.25%胰蛋白酶/EDTA(Gibco公司)在37℃下消化贴壁细胞，收集细胞并悬浮于hMSCs培养液，按1∶3比例传代培养，并标记为P1;此后可依此传代培养。传代过程中每隔3 d全量换培养液，直至贴壁细胞彼此融合,铺满整个培养瓶的底面;再重复以上的操作，将贴壁细胞消化分离，并按1∶2的比例进行下一代的传代接种培养，并标记为P2。 1.2.2 MSC的形态学鉴定：每日在倒置显微镜下观察贴壁细胞的细胞形态、密度和生长情况，取1、3、6代MSC，置于有玻片的3.5 cm直径平皿中，于37 ℃、体积分数为5% CO2的饱和湿度环境下培养1周，取出风干，用瑞士姬姆萨染色后在显微镜下观察细胞形态。 1.2.3 MSC表面标志的测定：以0.25%胰蛋白酶消化收获细胞，用PBS洗涤后计数，取2×106个细胞分别与 PE或 FITC标记的鼠抗人CD29、CD34、CD45、CD13、CD14、CD3、CD4、CD8(BD公司)、CD105(Caltag公司)、HLADR和CD20单克隆抗体室温避光反应30 min，用PBS洗涤2次(1000 r/min,5min/次);加1%多聚甲醛1 mL，摇匀，4℃保存，1周内用流式细胞仪(FACSCaliburBD公司，Cellquest软件分析)确定所分离培养的MSCs的表型和纯度。 1.2.4 MSC生长曲线测定：取P3代细胞制备单细胞悬液，调整细胞浓度至4×107/L，接种于24孔培养板(每孔200μL，37℃,体积分数为5% CO2的饱和湿度环境)培养，每3 d换液1次。从第2天起每隔24 h计数3孔细胞数，取其平均值作为当天细胞数，以细胞数为纵坐标，天数(8d)为横坐标，绘制细胞生长曲线。 1.2.5 MSC增殖能力鉴定：分离5×106个骨髓单个核细胞为起始在体外培养扩增MSCs，至P3、P4、P5代分别计数获得的MSCs数，将CMS组与对照组进行比较。 1.2.6 MSC传代能力比较：分离5×106个骨髓单个核细胞为起始在体外培养扩增MSCs，进行传代，记传代次数，将CMS组与对照组进行比较。 1.3 统计学处理方法 采用SPSS11.5统计分析软件包进行数据分析计算。计量数据以均数±标准差表示，两组比较采用成组t检验，计数资料以率表示，两组比较采用Fisher确切概率法检验;生长曲线结果采用重复测量方差分析。显著性检验水准为α=0.05。 2 结果 2.1 骨髓MSC的生长形态观察 倒置显微镜下观察，可见接种后24～48 h少部分单个核细胞贴壁，贴壁细胞呈圆形，有小的胞质突起。随着培养时间延长，贴壁细胞开始分裂增殖，细胞呈现出成纤维细胞样梭形外观，胞质丰富，核大居中，核仁明显，1周后，细胞融合成单层，形态均一，梭形突起变长，呈长梭形。贴壁的MSC增殖迅速，培养到10～14 d时，呈现90%以上的细胞融合，排列有明显方向性，细胞呈平行状、旋涡状、网状或辐射状生长。胰酶消化传代及冻存复苏后的细胞于24 h后完全贴壁，形态与原代相似。瑞士姬姆萨染色后，于光镜下可见成纤维样细胞形态，胞浆呈淡蓝色，可含空泡，可见数个深蓝色的核仁，染色质疏松，细胞呈平行排列生长或漩涡状生长(见图1)。CMS患者与对照组骨髓来源的MSC形态上差别不明显，两组MSC贴壁时间、集落大小无明显差异，均在36～48 h时间内贴壁。 图1 慢性高原病骨髓间充质干细胞形态(40×) 2.2 骨髓MSC表面标志分析 流式细胞仪检测结果表明，CMS组与对照组骨髓MSC均不表达典型的造血细胞抗原分子，如CD34、CD45、HLADR、CD4、CD8、CD80等，而CD29、CD105、CD13表达为阳性，其表达量在两组间无统计学差异。 2.3 CMS和对照组MSCs第三代(P3)生长曲线分析 CMS组骨髓MSCs在第4～5 d生长活跃，7 d后生长达平台期，对照组培养6 d后生长达平台期，结果见表1，图2。 2.4 CMS和对照组MSCs体外扩增数量比较 两组体外培养BMMNCs起始细胞数均为5×106个，体外扩增到P3、P4、P5时获得的细胞数比较，CMS组均显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。结果见表1～2。表1CMS和对照组骨髓MSCs生长曲线数值比较表2CMS和对照组骨髓MSCs体外扩增的数量 2.5 骨髓MSC传代率比较 15例CMS患者骨髓MSC均可分离培养，其中9例可传代扩增，传代率为60%，对照组各例均可传代扩增，传代率为100%，两组间差异有统计学意义(P <0.05)。经过动态观察发现，随着培养时间的延长，CMS组MSCs的生长速度和增殖能力逐渐下降，正常人骨髓MSC可传代到18代以上，而CMS患者骨髓MSC传代在12代以下。 3 讨论 CMS是长期生活在海拔2 500 m以上高原的世居或移居者，对高原低氧环境逐渐失去习服而导致的临床综合征，主要表现为红细胞增多、血红蛋白增高(女性≥190g/L，男性≥210g/L)和低氧血症[2]。CMS最根本的病因是缺氧，MSC对缺血缺氧的环境敏感，低氧影响着MSC的生理学特征[3]。关于CMS患者的MSCs的生物学特性、功能及其是否参与CMS发病的研究目前无报道。在本研究中我们对此做了初步的实验研究，结果成功地从CMS患者的骨髓中分离、培养、扩增得到MSCs，将其与正常同龄人骨髓来源的MSCs进行了生物学特征的比较，结果表明，来自CMS骨髓的MSCs在形态、表型特点上与正常人MSCs无异，尽管CMS和正常MSCs表面标志无明显不同，细胞生长的形态相似，但CMS患者MSCs体外传代生长较正常困难，而能体外传代生长的CMS骨髓MSCs表现较正常生长旺盛，分化程度较高。上述结果提示，CMS骨髓MSCs存在特有的生物学特点。 MSC是造血微环境的重要组成部分，因其具有自我更新、多向分化等干细胞特性及支持造血、免疫抑制等功能，近年来成为成体干细胞领域的研究热点[4]。MSC作为骨髓基质细胞的前体细胞，是骨髓内造血微环境的重要组成部分。对处于骨髓中的造血干细胞(HSC)不仅有空间位置的机械支持作用，还分泌多种生长因子,如SDF1、MCSF、SCF、FLT3L、TPO、IL7、GMCSF、GCSF、IL6、TGFβ、IFNγ、TNFβ和IL11等支持其造血功能，有助于HSC未分化状态的维持。此外，MSCs及其分化细胞表达的细胞外基质如粘附因子和整合素家族可直接作用于HSC，促进HSC的粘附和归巢。因此，MSC与HSC自我复制、增殖、分化及归巢密切相关。 本研究发现，在初接种时骨髓MSC呈圆形,贴壁后呈椭圆形;随着时间的推移,贴壁细胞呈成纤维细胞样，沿胞体长轴排列成单层，并以克隆形式增殖，分裂迅速;消化传代后细胞重复贴壁过程，细胞形态和原代无差异。传代培养时，骨髓MSC表现出旺盛的增殖能力，这些与相关报道一致[5,6]。在培养过程中还发现，CMS患者骨髓MSCs原代培养所需时间较长，约20～30 d左右才能达到传代的要求，这可能与CMS患者骨髓成熟红细胞数量多致骨髓液粘稠干扰MSCs的贴壁和生长有关。一旦原代培养成功，传代后细胞同样具有快速增殖能力。CMS患者骨髓MSCs的生长潜伏期为1～3 d，第4天起呈对数增长，至第7天达到高峰，平均8～10d可传一代。 CMS具有很强的体外增殖能力，本研究采用体外培养、传代的方法，观察了CMS患者骨髓MSCs不同代数扩增的细胞数，结果发现，CMS患者第2代、第3代和第4代MSCs扩增数均明显高于对照组，表明CMS患者MSCs具有更强的增殖能力。 体外实验表明，适度低氧下MSCs的生长和存活能力更好，产生集落形成单位的能力显著增高，且干细胞标志性基因表达水平更高[7]。氧浓度可以影响MSCs向成骨、成软骨、成脂的分化倾向，低氧能提高特异性受体和配体相结合所介导的迁移。低氧诱导因子1信号通路[8]在MSCs对缺氧反应的分子机制中占重要地位。 对缺氧反应的分子机制本实验主要研究了CMS患者骨髓MSC的形态、表型、传代能力、生长曲线及扩增能力等特征，其结果为CMS的研究提供了重要信息。但研究报道例数尚较少，结论还需要深入的体内实验及分子生物学研究支持。 【参考文献】 [2] 国际高原医学会慢性高原病专家小组.慢性高原病青海诊断标准[J].青海医学院学报,2005,26:35 [3] Zhu W,Chen J,Cong X,et al.Hypoxia and serum deprivationinduced apoptosis in mesenchymal stem cells[J].Stem Cells,2006,4:416425 [4] LeBlanc K, Rasmusson I, SundbergB, et al.Treatment of severe acute graftversushost disease with third party haploidentical 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