细胞间黏附分子1在红霉素抗炎机制中的作用

作者：李梅华 钟小宁 柳广南 何志义 朱 敏1 周 刚1    作者单位：(广西医科大学第一附属医院呼吸科，广西 南宁 530027)

【摘要】  目的 从分子水平上探讨红霉素(EM)的抗炎作用机制。方法 体外培养人支气管上皮细胞(16HBE)，将细胞随机分为8组，先加入EM干预，后加入肿瘤坏死因子α(TNFα)刺激。分组如下：①空白对照组;②TNFα(20 ng/ml,16 h)组;③EM(0.3 μg/ml，24 h)+TNFα(20 ng/ml，16 h)组;④EM(3 μg/ml，24 h)+TNFα(20 ng/ml，16 h)组;⑤EM(30 μg/ml，24 h)+TNFα(20 ng/ml，16 h)组;⑥EM(0.3 μg/ml，48 h)+TNFα(20 ng/ml，16 h)组;⑦EM(3 μg/ml，48 h)+TNFα(20 ng/ml，16 h)组;⑧EM(30 μg/ml，48 h)+TNFα(20 ng/ml，16 h)。然后收集各组细胞分别提取RNA，应用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)方法检测细胞间黏附分子1(ICAM1) mRNA的表达。因ICAM1 RTPCR产物分子大小约为700 bp，与原设计产物分子大小490 bp不相符，进一步作基因克隆测序了解基因之间是否具有同源性。结果 ICAM1的RTPCR产物即为目的基因：ICAM1基因。TNFα刺激人支气管上皮细胞(16HBE)后，细胞ICAM1mRNA表达增高。先加入不同浓度及作用时间的EM，后加入TNFα刺激人支气管上皮细胞(16HBE)，各组细胞ICAM1mRNA表达均降低，且提示有浓度与时间依赖性。结论 TNFα能激活人支气管上皮细胞使其ICAM1基因表达增高，促进炎症的发生发展。EM能抑制人支气管上皮细胞ICAM1基因表达，可能是EM的抗炎作用机制之一。

【关键词】  人支气管上皮细胞;细胞间黏附分子1;肿瘤坏死因子α;红霉素

Expression of intercellular adhesion molecule 1 mRNA in the antiinflammatory molecular mechanism of erythromycin

　　LI MeiHua, ZHONG XiaoNing, LIU GuangNan,et al.

　　Department of Resperatory, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi, China

　　【Abstract】 Objective To investigate the antiinflammatory molecular mechanism of erythromycin (EM) in order to find a new way to prevent and treat chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Methods Human bronchial epithelial cell line 16HBE was cultured with 10% serum DMEM (high glucose). The cells were randomly divided into eight groups: blank control group, TNFα (20 ng/ml,16 h), EM(0.3 μg/ml，24 h)+TNFα (20 ng/ml，16 h), EM(3 μg/ml，24 h)+TNFα (20 ng/ml，16 h), EM(30 μg/ml，24 h)+TNFα(20 ng/ml，16 h), EM(0.3 μg/ml，48 h)+TNFα (20 ng/ml，16 h), EM(3 μg/ml，48 h)+TNFα(20 ng/ml，16 h), and EM(30 μg/ml，48 h)+TNFα (20 ng/ml，16 h). Then total cellular RNA was extracted to detect the expression of ICAM1 mRNA by RTPCR. The molecular size of ICAM1 RTPCR production was not correspondent for what it was designed，therefore，clone sequencing was applied to confirm it. Results ICAM1 RTPCR production was ICAM1 mRNA. ICAM1mRNA was increased by the addition of TNFα,which was inhibited by the preincubation with EM in dosedependent and timedependent fasion. Conclusions ICAM1mRNA can be increased by the stimulation of TNFα, which indicate that EM modify inflammation presumably by suppressing ICAM1mRNA in human bronchial epithelial cells.

　　【Key words】 Human bronchial epithelial cells;ICAM1;TNFα;Erythromycin

　 长期应用小剂量红霉素(EM)治疗慢性气道感染性疾病〔弥漫性泛细支气管炎、支气管哮喘、支气管扩张、慢性阻塞性肺病等(COPD)〕取得良好的效果已经得到临床资料证实〔1～4〕。研究发现，这种疗效与EM抗菌活性无关，而与EM的抗炎活性密切相关〔5，6〕。EM在体内外对许多致炎细胞因子的产生均有调节作用，但是，EM抗炎作用机制仍不清楚。本实验设计研究EM对ICAM1基因表达的影响，从分子水平上探讨EM的抗炎作用机制，为临床防治老年慢性阻塞性肺病提供新的思路。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 高糖(DMEM)培养基为Hyclone公司产品，胎牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司产品，肿瘤坏死因子(TNFα)系Sigma公司产品，EM系Amresco公司产品。总RNA提取试剂Trizol购自Invitrogen公司，AMV逆转录酶和dNTPs购自美国Promega公司，TaqDNA聚合酶购自TAKARA公司，DEPC系美国Serva公司产品，琼脂糖购自上海生工生物工程公司。琼脂糖凝胶回收试剂盒及pGEMTeasy试剂盒(含T4 DNA连接酶)系Qbiogene公司产品。常规试剂：异丙醇、乙醇、氯仿、Tris粉、EDTA等系国产分析纯试剂。OligodT15，βactin引物：上游5′TGACGGTCAGGTCATCACTATCGGCAATGA3′，下游5′TTGATCTTCATGGTG(AGC) TAGGAGCGAGGGCA 3′，由上海生工生物工程公司合成。ICAM1引物：上游5′AGGTGGCCGGCCAGCTTATA3′，下游5′CCTGTCCCGGGATAGGTTCA3′，由北京奥科生物技术有限责任公司合成。

　　1.2 细胞培养 人支气管上皮细胞(16HBE)(美国加州大学)由中南大学湘雅医学院细胞中心提供，含10%胎牛血清的DMEM培养体系6～10 ml，细胞密度1～2×106/ml接种于50 ml培养瓶，于37℃，5%CO2培养箱中培养。细胞长满70%～80%时随机分为8组：①空白对照组，②TNFα(20 ng/ml，16 h)组，③EM(0.3 μg/ml，24 h)+TNFα(20 ng/ml，16 h)组，④EM(3 μg/ml，24 h)+TNFα(20 ng/ml，16 h)组，⑤EM(30 μg/ml，24 h)+TNFα(20 ng/ml，16 h)组，⑥EM(0.3 μg/ml，48 h)+TNFα(20 ng/ml，16 h)组，⑦EM(3 μg/ml，48 h)+TNFα(20 ng/ml，16 h)组，⑧EM(30 μg/ml，48 h)+TNFα(20 ng/ml，16 h)组。

　　1.3 逆转录聚合酶链反应(RTPCR)

　　1.3.1 提取细胞总RNA(按Trizol说明书) 取1 ml内含1×106个细胞的培养液于1.5 ml Eppendorf离心管中，4℃，2 000 r/min离心5 min，弃上清液。加入1 ml Trizol分离试剂，用移液器吸头吸打重悬细胞沉淀，室温孵育5 min。加入0.2 ml氯仿，振摇15 s，室温孵育10 min。4℃，13 000 r/min离心15 min，收集上层无色水相于1.5 ml Eppendorf管中，弃沉淀管。加入0.5 ml异丙醇，振荡混匀，室温孵育5 min。4℃，13 000 r/min离心10 min，弃上清液。加入1 ml 75%乙醇并震荡。4℃，13 000 r/min离心10 min，弃上清液。真空干燥离心机干燥5 min。加入8 μl DEPC处理水溶解RNA。取2 μl电泳分析RNA质量。

　　1.3.2 逆转录反应 各组提取的总RNA重悬于6 μl DEPC水中，加入8 U RNasin，Oligod T15(500 ng/μl)，ICAM1下游引物50 pmol，混匀，13 000 r/min离心30 s，70℃水浴5 min，然后立即置冰上冰浴(退火)。20 μl RT反应体系中含5×RT缓冲液4 μl，12 U RNasin，4μl 2.5 mmol/L dNTPs，5 U AMV逆转录酶，然后用DEPC处理水补足终体积至25 μl，轻敲混匀，稍离心，42℃水浴1.5 h后，于-20℃保存。

　　1.3.3 聚合酶链反应(PCR) 取逆转录产物为模板，扩增βactin、ICAM1基因。ICAM1，βactin PCR反应条件：取RT反应产物2 μl为模板，加入10×PCR buffer 2μl，2.5 mmol/L dNTPs 2 μl，25 mmol/L MgCl2 1.5 μl，ICAM1上游引物0.5 μl(10 pmol/μl)，βactin上、下游引物各0.5 μl(10 pmol/μl)，补充消毒双蒸馏水9 μl，再加入5 U/μl TaqE 1 μl，加入约25 μl左右的矿物油盖于液面上。扩增参数为94℃，30 s，57℃，30 s，72℃，30 s，循环30次，然后72℃延伸10 min，停止，4℃保存。ICAM1扩增片段长度为490 bp，βactin扩增片段长度为260 bp。

　　1.3.4 cDNAPCR产物电泳和照相分析 取PCR产物5 μl，经1.5%琼脂糖凝胶电泳，以Generuler 100 bp DNA Ladder Marker为分子量标准，英国GENEGENIUS快速成像系统摄影，图片经英国GENEGENIUS图像分析处理系统分析，对扩增产物条带进行扫描，记录光密度值，以ICAM1/βactin的比值作为ICAM1 mRNA表达的相对含量。

　　1.4 克隆测序 回收ICAM1扩增产物(PCR产物)，经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收扩增目的片段;按产品说明书要求进行PCR产物与T载体连接反应，CaCl2法制备大肠杆菌DH5α新鲜感受态细胞100 μl，然后加入连接反应产物进行转化，转化产物均匀涂布于氨苄青霉素阳性(100 μg/ml)LB固体培基平板上，37℃倒置平板过夜培养;第二天挑取培养板上数个单克隆菌落，接种至氨苄青霉素阳性(100 μg/ml)LB液体培基(10 ml)，37℃，220 r/min，空气摇床上振荡培养过夜。取菌液1 μl为模板在50 μl体系中进行PCR扩增鉴定，随机挑选获阳性扩增结果者送样至上海博亚生物技术公司进行序列分析。

　　2 结 果

　　2.1 RTPCR结果 TNFα刺激16HBE16 h后，与空白对照组比较，ICAM1 RTPCR产物表达明显增高;先予不同浓度的EM作用于16HBE 24 h或48 h后，再用TNFα刺激16 h，与仅用TNFα刺激组比较，各组16HBE ICAM1 RTPCR产物表达均降低，且提示有浓度和时间依赖性。见图1，表1。

　　1.Marker;2.对照组;3.TNFα(20 ng/ml16 h)刺激组;4.EM(0.3 μg/ml24 h)+TNFα(20 ng/ml16 h);5.EM(3 μg/ml24 h)+TNFα(20 ng/ml16 h);6.EM(30 μg/ml24 h)+TNFα(20 ng/ml16 h);7.EM(0.3 μg/ml48 h)+TNFα(20 ng/ml16 h);8.EM(3 μg/ml48 h)+TNFα(20 ng/ml16 h);9.EM(30 μg/ml48 h)+TNFα(20 ng/ml16 h)

　　2.2 RTPCR和克隆测序结果 ICAM1 RTPCR产物分子大小约为700 bp，与原设计产物分子大小490 bp不相符，进一步作克隆测序了解基因之间是否具有同源性。将ICAM1 PCR产物DNA序列与ICAM1基因进行blast比较，具有高度同源性，显示PCR产物即为目的基因：ICAM1基因。见图2。　表1 EM对ICAM1 mRNA表达的影响

　　3 讨 论

　　细胞间黏附分子1(ICAM1)是细胞表面黏附分子，属免疫球蛋白超家族，能与白细胞功能相关抗原1(LFA1)即(CD11a/CD18)结合发挥作用。主要分布在各种上皮细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞、单核巨噬细胞和淋巴细胞等，ICAM1的生物学功能包括细胞黏附，细胞分化发育，参与抗原呈递和T细胞活化，细胞介导的细胞毒作用，炎症等多方面。本实验结果发现，提取16HBE细胞ICAM1mRNA进行RTPCR，RTPCR产物DNA序列与ICAM1基因具有高度同源性，显示PCR产物即为目的基因：ICAM1基因。但两者之间存在差异，本实验提示，不同种族、不同组织细胞ICAM1基因表达可能具有一定差异性。

　　TNFα是一种作用很强的细胞因子，除对肿瘤细胞有特异的杀伤作用外，还有抗病毒、激活T细胞、促进细胞因子分泌和诱发炎症反应等重要生物功能。本组实验观察到，TNFα刺激16HBE引起ICAM1mRNA表达增高，与以往的报道类似〔7〕，TNFα可诱导一系列与炎症有关的细胞因子〔如IL1、IL6、IL8、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)〕、黏附分子〔如ICAM1、血管细胞间黏附因子1(VCAM1)〕的生成，通过诱导这些因子的产生和释放，造成机体炎症损伤，同时，通过再激活炎症效应细胞，释放更多的炎性因子，使炎症信号进一步放大和加强。本实验还显示，不同浓度EM作用于16HBE 24 h或48 h后，再用TNFα刺激16 h，与仅用TNFα刺激组比较，16HBE ICAM1mRNA表达均降低，提示有浓度和时间依赖性。本实验从分子水平上说明EM能抑制ICAM1mRNA表达，且与其作用浓度和时间相关，这一机制可能是EM抗炎作用机制之一。在国外，Suzuki等〔8〕研究发现，EM抑制病毒感染人气管上皮细胞导致的ICAM1分泌从而调节气道炎症。Sanz等〔9〕报告在老鼠体内实验中，EM抑制白细胞在肺内的聚集，其机制是通过下调ICAM1mRNA和VCAM1 mRNA表达。Li等〔10，11〕研究结果显示大环内酯类抗生素能抑制博来霉素诱导大鼠的急性肺损伤和肺纤维，其作用机制主要是通过抑制ICAM1mRNA和VCAM1mRNA表达从而抑制白细胞特别是中性粒细胞向气道内迁移。有临床实验证明，长期小剂量EM治疗COPD患者，可显著减少患者感冒发生率，对阻止COPD患者病情恶化有良好的效果，这种效果是EM的抗炎而非抗菌机制所致，可能与EM能抑制16HBE表达和释放IL6、IL8和ICAM1有关〔12〕。

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