编码大鼠Nogo受体mRNA的shRNA重组腺病毒载体的构建和鉴定

作者：张沁丽，秦新月，殷成，彭彦    作者单位：1重庆医科大学附属第一医院神经内科，重庆市神经病学重点实验室，2重庆医科大学组织胚胎学教研室，重庆 400016

【摘要】  　　目的: 构建Nogo受体(NgR)特异性shRNA重组腺病毒载体,为应用基因沉默技术从转录后水平进行缺血性脑损伤的基因治疗研究奠定基础. 方法: 将前期构建的大鼠Nogo受体mRNA的shRNA特异性真核表达载体pGenesil1shRNA的表达启动子U6连同shRNA亚克隆至穿梭质粒pAdTrack,酶切及DNA测序鉴定后， 将含NgR基因的重组穿梭质粒pAdTrackU6shRNA经PmeI线性化后转化入pAdEasy1感受态细菌. 将pAdU6shRNA质粒经PacI线性化后转染293细胞，包装重组腺病毒AdenoU6shRNA，并进行PCR鉴定、PCR产物测序及病毒滴度测定. 结果: 结果证实pAdTrackU6shRNA及pAdU6shRNA质粒构建正确，收获病毒后的PCR及DNA测序结果证明AdenoU6shRNA包被成功. 结论: 成功构建了大鼠Nogo受体mRNA的shRNA重组腺病毒载体AdenoU6shRNA，将为应用基因沉默技术研究NgR在缺血性脑损伤后神经再生中的作用奠定基础.

【关键词】  Nogo受体；RNA干扰；腺病毒

　　Construction and identification of recombinant adenovirus expressing the shRNA of rat Nogo66 receptor

    ZHANG QinLi1, QIN XinYue1, YIN Cheng1, PENG Yan2

    1Department of Neurology, First Affiliated Hospital, 2Department of Histology and Embryology, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China

    【Abstract】 AIM: To construct the recombinant adenovirus vector of shRNA targeted to the rat Nogo66 receptor gene for the therapy of ischemic brain injury in posttranscriptional regulation. METHODS: The used pGenesil1shRNA was construsted and identified in previous experiment. The U6 and shRNA of pGenesil1shRNA were subcloned to pAdTrack. The product pAdTrackU6shRNA was linearized by Pme I to mediate homologous recombination with pAdEasy1 in pAdEasy1 host bacteria. The positive clone was identified by enzyme digestion, PCR analysis and DNA sequence analysis. After linearized by Pac I, the recombinant adenovirus DNA pAdU6shRNA was transfected into 293 cells for packaging and amplification of AdenoU6shRNA. AdenoU6shRNA was further identified by PCR analysis and DNA sequence analysis. RESULTS: PCR analysis, enzyme digestion and DNA sequence analysis proved the pAdTrackU6shRNA and the pAdU6shRNA had been successfully constructed. After being packaged in 293 cells, the recombinant adenovirus AdenoU6shRNA was identified by PCR analysis and DNA sequence analysis. CONCLUSION: We have successfully constructed recombinant adenovirus AdenoU6shRNA targeted against the rat Nogo66 receptor gene. It will be helpful to use RNAi in the research of the role of NgR in neural regeneration after cerebral ischemic injury.

    【Keywords】 Nogo66 receptor; RNAi; adenoviruses

　　0引言

    缺血性脑损伤后中枢神经的再生是神经康复难以逾越的障碍，近来研究发现，中枢神经再生困难的原因是CNS三种轴突再生抑制蛋白的存在，它们是NogoA,MAG和OMgp，与共同的受体NgR结合，激活下游信号及GTPase Rho系统，导致轴突生长锥崩溃［1］. 因此，NgR成为理想的治疗靶. RNA干扰(RNAi)是由双链RNA介导的、在转录后mRNA水平关闭相应基因表达过程-将与靶基因同源的21~23 bp的双链RNA导入细胞,它在细胞中可与靶基因mRNA结合,并迅速将其降解,从而抑制该基因的表达的过程［2］.而成功地进行RNAi的关键在于使siRNA导入细胞，我们利用前期实验已构建的NgR shRNA真核表达载体，进一步构建腺病毒表达载体，通过病毒载体导入NgR siRNA沉默NgR基因，从而达到拮抗NgR基因的效应，促进神经再生.

    1材料和方法

    1.1材料pGenesil1shRNA质粒前期实验已构建成功， pAdTrack,pAdEasy1质粒，DH5α,Top10,BJ5183菌种，293细胞由重庆医科大学基础研究所实验室提供，限制性内切酶EcoR I,Sal I购自Takara,T4 DNA连接酶购自Promega公司，Pme I,Pac I购自New England Biolab公司，测序引物由重庆升博生物技术有限公司合成. 质粒小量抽提试剂盒购自上海华舜生物技术有限公司，胶回收试剂盒购自Genemega公司，PCR试剂盒购自BioFlux公司.

    1.2方法

    1.2.1腺病毒穿梭载体pAdTrackU6shRNA的构建将pGenesil1用HindⅢ和Sal I双酶切，回收小片段，再将腺病毒穿梭质粒pAdTrack用HindⅢ和Sal I双酶切，回收大片段，4℃下T4 DNA连接酶连接过夜，阳性克隆HindⅢ和Sal I双酶切鉴定，EcoRI单酶切鉴定，进一步经DNA双向测序确认构建无误.

    1.2.2重组腺病毒载体pAdEasyU6shRNA的构建采用细菌内同源重组的方法构建重组腺病毒质粒pAdEasyU6shRNA. 先将pAdEasy1转化人大肠杆菌BJ5183，制备AdEasy1细菌. 从AdEasy1细菌中抽提质粒pAdEasy1并用HindⅢ酶切，选取与原始pAdEasy1质粒具有相同酶切图谱的AdEasy1菌株，再按氯化钙法制备成AdEasy1感受态细菌. 重组穿梭质粒pAdTrackU6shRNA经Pme I线性化后取约150 ng转化100 μL AdEasy1感受态细胞，在浓度为50 mg／L卡那霉素抗性LB平板上筛选，37℃培养18～20 h后，挑选体积最小的克隆，立即摇菌抽提质粒，用PCR及Pac I酶切鉴定，由于目的基因有4条，针对每一条分别设计引物代价较大，于是在目的基因两端设计引物，扩增出含有目的基因的大片段. 引物序列如下：(Sense primer) 5′ GCCAAGTGGGCAGTTTACC 3′,(Antisense primer) 5′ TAGAGTTTGCGGGCAGGAC 3′.对PCR产物进行DNA序列测定. PCR反应参数：94℃变性5 min. 94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环后，72℃延伸8 min. 鉴定后pAdEasyU6shRNA在大肠杆菌Top10中扩增.

    1.2.3重组腺病毒的包装与扩增①293细胞培养：常规复苏293细胞，用含100 mL/L胎牛血清和100万U／L青霉素，100万U／L链霉素的DMEM培养液培养，达对数生长期时按1∶5传代，部分冻存建库，部分为实验用. ②293细胞转染：重组pAdEasyU6shRNA质粒经Pac I酶切过夜充分线性化后乙醇沉淀线形DNA. 用Lipofectamine2000阳离子脂质体进行转染：当25 cm2细胞丰度达70％ 时(转染前1 d血清无双抗DMEM培养)，取10 μL脂质体和4 μg DNA分别用500 μL单纯DMEM培养基稀释后再混合，混合液加入1 mL 单纯DMEM培养基中和细胞在37℃，50 mL/L CO2培养箱孵育，5～6 h后将转染液更换为6 mL DMEM完全培养基. ③病毒的包装与扩增：细胞出现CPE前正常换液，出现CPE后用NaHCO2调节培养液pH值，转染8 d后细胞大量脱落，此时进行收集. 1000 r／min低速离心去培养液，用1 mL PBS重悬细胞，于-80℃和37℃之间反复冻融3次，4℃下5000 r／min离心20 min收集病毒上清. 第一批上清液进行PCR鉴定，重组的病毒颗粒反复感染293细胞进行大量扩增(共2次，每次感染2个规格为75 cm2方瓶细胞量). 病毒液用0.22 m滤膜无菌过滤后分装于2 mL冻存管，-80℃保存. ④重组腺病毒滴度测定:在24孔板中接种1×105细胞/孔，待细胞达到70％融合时加入用DMEM 培养液等比稀释的待测病毒400 μL，放置37℃吸附90 min后，吸弃病毒，加入1 mL DMEM完全培养基继续培养18～24 h后，于荧光显微镜下计数GFP 阳性细胞数. 按下列公式计算病毒滴度: 病毒滴度（pfu/mL）＝（GFP 阳性细胞数×病毒上清稀释倍数）/0.4 mL ⑤重组腺病毒PCR鉴定：取第一轮扩增后收集的病毒上清5 μL，加入10 μL蛋白酶K，55℃孵育1 h，100℃沸腾5 min，离心后取1～2 μL上清 进行PCR 鉴定. PCR反应参数为：94℃变性5 min， 94℃变性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸1 min，35 个循环后，72℃延伸8 min. PCR产物送生物技术公司测序.

    2结果

    2.1腺病毒穿梭载体pAdTrackU6shRNA的构建和鉴定重组穿梭质粒pAdTrackU6shRNA经HindⅢ和Sal I双酶切后，用10 g/L的琼脂糖凝胶电泳鉴定产生8300 bp大片段同410 bp的目的基因片段，经EcoRI单酶切后，由于pAdTrack多克隆位点外已有一个EcoRI的酶切位点，目的基因含有一个EcoRI酶切位点，因此重组穿梭质粒会被EcoRI切出约6000 bp和2670 bp大小的两条片段（图1），进一步经测序鉴定U6shRNA已准确无误插入穿梭质粒pAdTrack.

    1: marker  DL2000;  2: pAdTrackU6NgR1shRNA被EcoRI单酶切; 3: pAdTrackU6NgR1shRNA被SalI HindⅢ双酶切; 4: pAdTrackU6NgR1shRNA;  5: marker λHind Ⅲ.

    图1穿梭载体pAdTrackU6shRNA酶切鉴定

    2.2重组腺病毒载体pAdEasyU6shRNA的构建和鉴定线性化的pAdEasyU6shRNA转化pAdEasy1感受态后，第18 h可观察到卡那抗性平板上均匀分布着大小不一的白色菌落，挑取体积较小的克隆抽提质粒后用PacI酶切，经8 g/L的琼脂糖凝胶电泳鉴定，切出一条约33 000 bp大片段和一条约4500 bp的特征性小片段. 由于pAdEasy1不具有卡那霉素抗性而同源重组后形成的pAdEasyU6shRNA质粒获得了卡那霉素抗性，因此从卡那霉素抗性克隆中抽出的质粒经PacI鉴定后初步认定为重组成功的pAdEasyU6shRNA质粒. 质粒DNA重新转化Top10进行扩增，扩增后的质粒进行PCR鉴定，在约870 bp的特异性位置扩增出目的条带，质粒经Pac I酶切同样切出33 000 bp左右大片段和约4500 bp特征片段（图2），证实pAdEasyU6shRNA质粒已重组成功.

    1～3: pAdEasyU6shRNA被PacI单切;4: pAdEasyU6shRNA;5: pAdEasy1被PacI单切;6: pAdEasy1;7:marker λHind Ⅲ.

    图2重组腺病毒载体pAdEasyU6shRNA酶切鉴定

    2.3重组腺病毒的包装和扩增重组腺病毒转染293细胞24 h后荧光显微镜下即可见约10％的细胞有GFP表达，GFP的表达随着时间的延长而逐渐增多，荧光增强，荧光斑点数增多，随后荧光斑点扩大，形成明显的噬斑，取适量鉴定正确的病毒上清重复感染293 细胞，扩增后收集病毒液（图3）.

    2.4腺病毒PCR鉴定重组空病毒可以扩增出约460 bp大小的片断，而带目的基因的重组病毒则可以扩增出约870 bp的片断，与设计相符，说明含U6shRNA基因的pAdTrackU6shRNA已与腺病毒核心基因组pAdEasy1发生了重组，并且重组腺病毒包装成功（图4）.

    2.5测序鉴定及滴度测定PCR产物测序结果同设计完全相符，证明我们成功构建了编码大鼠Nogo受体mRNA的shRNA特异性重组腺病毒载体. AdenoU6shRNA经繁殖、扩增后测定滴度，三条干扰片断NgR1，NgR2，NgR3腺病毒载体滴度分别为4.0×109，5.5×109，3.0×109 pfu/mL，阴性对照NgRHK滴度为4.6×108 pfu/mL.

    A: 2 d;   B: 4 d;   C: 7 d;   D: 病毒扩增.

    图3重组腺病毒的包装及扩增

    1～4:重组带目的基因病毒PCR结果; 5:重组空病毒PCR结果; 6～9: pAdEasyU6shRNAPCR结果;10:同源重组空质粒PCR结果; 11: marker DL2000.

    图4pAdEasyU6shRNA及病毒DNA的PCR鉴定

    3讨论

    Nogo66受体NgR自发现以来［3］，引起了全世界神经科学家极大的兴趣，为人类深入研究髓鞘介导的神经再生抑制带来了新的契机，NgR已知是一个碱性磷酸酶（AP）熔合蛋白，它能高亲和性地与碱性磷酸酶及谷胱甘肽S转换酶（GST）蛋白结合并与Nogo66熔合. Nogo受体主要表达在CNS神经元及其轴突，并通过glycosylphosphatidylinositol（GPI）的一部分附着于浆膜的外小叶，表达于神经元的膜表面. NgR与其协同受体p75NTR［4］共同传递少突胶质细胞至神经元的抑制信号，因此，NgR在制约成年CNS损伤后的神经轴突再生中起着非常重要的作用. 髓鞘蛋白Nogo，OMgp和MAG共享NgR，表明NgR可能是神经生长中的一个至关重要的调控物质. Strimmater等［5］运用缩氨酸拮抗剂（NEP140）治疗脊髓损伤，以阻断髓鞘少突胶质细胞Nogo66与神经元 NgR的结合，其结果能有效地促进大鼠神经功能的恢复.

    RNAi作为新兴的基因阻断技术，理论上可用于治疗任何由于单个基因高表达引起的疾病［6］. RNAi为双链RNA介导的基因转录后沉默，具有特异、高效等特点. siRNA为RNAi的关键效应分子，因此siRNA导入效率将是沉默成功与否的关键，制备siRNA的方法主要有体外化学合成和DNA载体细胞内表达siRNA. 化学合成siRNA对靶基因的抑制是瞬时的，质粒细胞内表达siRNA对靶基因的抑制也是暂时的；而应用病毒进行RNAi，可以感染不同细胞类型，可以提高siRNA转入细胞效率，既可以转染分裂细胞又可以转染静止细胞，还可以进行活体转染. 并于细胞内较长期介导siRNA抑制靶基因表达，其中腺病毒更具有感染细胞谱广、病毒滴度高、易于浓缩及贮存等优点［7-8］. 因我们拟将siRNA导入体外培养的海马脑片缺血模型中，但海马脑片培养属于原代培养，加之海马神经元属于终末细胞，于是普通质粒载体转染的效率受到抑制，因此构建siRNA重组腺病毒载体，通过重组腺病毒导入siRNA，可以提高转染效率，为进一步的RNAi研究提供了可行性保障.

【参考文献】
［1］ Woolf CJ, Bloechlinger S. It takes more than two to Nogo ［J］. Science, 2002, 297(5584): 1132-1134.

［2］ Yu JY,DeRuiter SL,Turner DL. RNAs interference by expression of short interferencing RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells ［J］. Proc Natl Acad Sci USA,2002,99(9):6047-6025.

［3］ Fournier AE, GrandPre T, Gould G, et al. Nogo and the Nogo66 receptor ［J］.Prog Brain Res, 2002,137:361-369.

［4］ Wang KC，Kim JA，Sivasankaran R，et al．p75 interacts with the Nogo receptor as a coreceptor for Nogo．MAG and OMgp ［J］．Nature,2002,420:74-77.

［5］ McGee AW, Strittmatter SM. The Nogo66 receptor : Focusing myelin inhibition of axon regeneration ［J］. Trends Neurosci, 2003,26(4): 193-198.

［6］ DammWelk C, Fuchs U, Wossmann W, et al. Targeting oncogenic fusion genes in leukemias and lymphomas by RNA interference ［J］.Semin Cancer Biol,2003,13(4):283-292.

［7］ He TC，Zhou S，da Costa LT，et al. A simplified system for generating recombinant adenoviruses ［J］．Proc Natl Acad Sci USA，1998，95(5)：2509-2514.

［8］ Sui G，Soohoo C，Affarel B，et al. A DNA vector based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells ［J］. Proc Natl Acad Sci USA，2002，99(8)：5515-5520.