高原低氧对解偶联蛋白2 mRNA表达的影响
| 高原低氧对解偶联蛋白2 mRNA表达的影响 |
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作者：邵雪 高继东 圈启芳 格日力 作者单位：1青海大学医学院;2青海大学附属医院 【摘要】 目的 探讨高原低氧对Wistar大鼠白色脂肪组织(White Adipose Tissue ,WAT)解偶联蛋白2(Uncoupling Protein 2,UCP2)mRNA表达的影响。方法 将60只雄性Wistar大鼠随机分成6组，每组10只，分为对照组、低氧1天组、低氧3天组、低氧7天组、低氧15天组和低氧30天组。分别在西宁和可可西里地区(1天、3天、7天、15天和30天)采集WAT标本，应用半定量逆转录-聚合酶链式扩增反应(RT-PCR)方法检测UCP2 mRNA的表达水平。结果 低氧1天组、低氧3天组、低氧7天组、低氧15天组和低氧30天组的UCP2 mRNA表达水平降低，尤以30天组降低明显。血红蛋白值与UCP2 mRNA的表达呈较高的负相关。结论 随着低氧时间的延长，UCP2 mRNA的表达水平逐渐降低是对低氧环境的一种适应性反应。 【关键词】 低氧 解偶联蛋白2 mRNA 高原 THE EFFECT OF HIGH ALTITUDE HYPOXIA ONEXPRESSION OF UNCOUPLING PROTEN 2 mRNA Shao Xue1, Gao Jidong2, Juan Qifang2, Ge Rili1 (1.Qinghai University Medical Colloge; 2.Affiliated Hospital of Qinghai University) Abstract Objective To investigate the effect of high altitude hypoxia on expression of uncoupling protein 2(UCP2) in white adipose tissue (WAT) of Wistar rats. Methods 60 male Wistar rats were randomly divided into 6 groups. They were control, high altitude group 1 day, 3 days, 7 days, 15 days and 30 days, each group has 10 Rats were sacrificed and WAT samples were collected at the same plot. Semi-quantitative reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR) was employed to measure the expression level of UCP2 mRNA in WAT. Results The expression level of UCP2 mRNA reduced in 1 day, 3days, 7days, 15days and 30 days' groups, and the group of 30 days' reduced significantly. Conclusion The expression level of UCP2 mRNA reduced gradually that maybe is one of acclimation responses to hypoxia environment. Key words Hypoxia Uncoupling protein2 mRNA Plateau 真核细胞都是利用氧化磷酸化来维持它们的高能磷酸盐的储备，其氧耗依赖ATP。当细胞缺氧时，细胞的生存就会受到威胁，所以所有细胞都有能力在氧供应有限甚至降低的情况下产生一定适应性以提高其存活能力。机体的能量代谢是一个非常复杂的过程，线粒体在能量代谢中发挥着重要的作用。解偶联蛋白(Uncoupling Proteins,UCPs)是线粒体内膜的转运蛋白，其主要的分子生物学功能是传输质子进入线粒体，阻止线粒体合成ATP并增加产热。解偶联蛋白家族中UCP2基因定位于人的11号染色体(11q13)，小鼠的7号染色体，此区域与肥胖及高胰岛素血症有关[1]。而持续性低氧环境下UCP2 mRNA有何变化目前尚不清楚，因此本次实验在特高海拔(4 615 m)进行为期30天标本采集与测定，以探讨高原低氧环境对大鼠UCP2 mRNA表达的影响。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物：雄性Wistar大鼠购于甘肃中医学院科研实验中心，体重(200±20)g，随机分为对照组、低氧1天组、低氧3天组、低氧7天组、低氧15天组和低氧30天组，每组10只，分别于西宁(海拔2 260 m)和可可西里地区(海拔4 615 m)饲养，予动物自由进食饮水。将西宁0天，可可西里1天、3天、7天、15天、30天组大鼠取腹主动脉血3 ml用以检测血红蛋白，取睾丸周围白色脂肪组织(WAT)用锡纸包裹后迅速放入液氮中冷冻，最后放置于-80℃超低温冰箱中保存，备检UCP2 mRNA。 1.1.2 主要试剂：总RNA提取试剂盒购于invitrogen公司。反转录试剂盒购于Fermentas life sciences公司。PCR试剂盒购于Fermentas(MBI)公司。 1. 2 方法 1.2.1 血红蛋白测定：采用沙利氏血红蛋白比色计测定。 1.2.2 总RNA的提取：按照invitrogen公司的Trizol Reagent试剂盒的操作步骤提取组织中总RNA。取100 mg冻存的WAT，加入1ml Trizol溶液,充分匀浆后,再以氯仿抽提,异丙醇沉淀提取细胞总RNA,最后用1 ml 70%的乙醇冲洗、离心、干燥后用DEPC处理水溶解。用琼脂糖凝胶电泳法检测RNA的完整性，用核酸蛋白检测仪(YXS1-1)检测RNA的含量与纯度,取OD260/OD280值在1.8～2.0之间的RNA用于CDNA第一链的合成。 1.2.3 大鼠UCP2 mRNA引物的设计和合成：根据引物设计DNAMAN软件设计引物序列：UCP2基因上游引物为5’-aggagagagtcaagggcta-3’，下游引物为5’- gaaggcagaagtgaagtgg-3’，预期扩增产物片断长度为535bp;β-actin为内对照，β-actin的上游引物为5’-tctacaatgagctgcgtgtg-3’，下游引物为5’-ggtcaggatcttcatgaggt-3’，预期扩增产物片断长度为314 bp。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，工作浓度为10 μM。 1.2.4 cDNA第一链的合成:逆转录反应按照Fermentas life sciences公司的反转录试剂盒(RevertAidITM First Strand cDNA Synthesis Kit #K1622)的操作步骤进行。取总RNA 5 μg,Oligo(dT)18引物1 μl,加入DEPC处理水至12 μl，70℃加热5 min后迅速置于冰浴中，再加入5×反应缓冲液4 μl，RibolockTM核糖核酸酶抑制剂(20U/μl) 1 μl，10mM dNTP mix 2 μl， 37℃加热5 min，再加入M-MuLV逆转录酶(200U/μl) 1 μl，终体积为20 μl。42℃加热60 min，70℃加热10 min后停止反应。反应物于-20℃保存。 1.2.5 目的cDNA的扩增：取逆转录产物2 μl，UCP2基因上、下游引物各1.0 μl，β-actin上、下游引物各1.0 μl，dNTPMix (各10 mM) 1.0 μl，MgCl2(25 mM) 3.0 μl，10×Taq Buffer with (NH4)2SO4 5 μl，Taq DNA Polymerase (5 U/μl) 0.5 μl，灭菌蒸馏水37. 5 μl，总体积50 μl。反应条件为95℃加热5 min，94℃变性0.5 min，64℃退火1 min，72℃延伸1 min，29个循环后，72℃再延伸5 min。RT-PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后用凝胶图像扫描仪(UltravioletTransillumina-tion，UVP)进行灰度扫描，以β-actin为内参照，测得UCP2 mRNA与β-actin mRNA的基因条带的灰度比值表示各实验组mRNA的相对值。分析软件为Labworks TM 4. 0。 1.3 统计学处理方法 所有数据均采用SPSS15.0统计软件处理，结果以均数±标准差( x±S)表示，显著性检验采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法，同时做Spearman秩相关检验。检验水准α=0.05。 2 结果 2.1 各组间血红蛋白的比较 本研究结果显示，大鼠急进入高原后，随着时间的延长，血红蛋白在各组呈逐步增高的趋势并有统计学意义(F =18.155，P <0.001)。其中低氧3天组、低氧7天组、低氧15天组和低氧30天组与西宁对照组比较均有统计学意义(见表1)。表1各组大鼠血红蛋白指标比较结果注：﹡与对照组比较，P<0.05;﹟与低氧1天组比较，P<0.05;◇与低氧3天组比较，P<0.05;☆与低氧7天组比较，P<0.05. 2.2 各组间UCP2 mRNA相对水平的比较 UCP2 mRNA的表达量随着低氧时间的延长逐渐降低，以低氧30天组降低最明显，均值较对照组降低幅度约为61%。组间降低的差异具有统计学意义(F =144.655，P <0.001)，并且两组之间分别比较存在明显不同(表2)。表2各组大鼠UCP2 mRNA相对水平的比较结果注：﹡与对照组比较，P<0.05;﹟与低氧1天组比较，P<0.05;◇与低氧3天组比较，P<0.05;☆与低氧6天组比较，P<0.05;□与低氧15天组比较，P<0.05. 2.3 各组大鼠 WAT中UCP2与β-actin琼脂糖凝胶电泳结果分析 UCP2的条带逐渐变暗，高原低氧30天组的条带明显暗于其他5组(图1)。 图1 各组大鼠WAT中UCP2和β-actin的典型电泳图 (1.对照组，2.低氧1天组，3.低氧3天组，4.低氧7天组，5.低氧15天组，6.低氧30天组) 2.4 UCP2 mRNA与血红蛋白的相关性分析 UCP2 mRNA表达水平与血红蛋白呈中度负相关，rs =-0.700，P <0.001，表明随着血红蛋白值的升高，UCP2的表达水平降低(图2)。 图2 UCP2 mRNA与血红蛋白的相关性图 3 讨论 人体在进入高原地区后，面临的最大问题是低张性缺氧。机体对低氧刺激的反应，最简单的方式就是增加血液内的红细胞和血红蛋白数目，从而增加携氧的能力，以弥补大气中的供氧不足。随着海拔高度的增高，缺氧程度加重，红细胞和血红蛋白增多更加明显。本实验结果显示血红蛋白随低氧时间的延长呈进行性升高这是机体对低氧应激的一种积极反应。 解偶联蛋白(UCPs)是线粒体内膜的质子载体，可以将内膜外侧的H+运回内侧降低了物质氧化过程与H+形成的膜两侧电化学梯度,使氧化过程与磷酸化过程脱偶联,ATP生成减少、能量消耗和产热增多、体重下降、促进机体尤其是脂肪细胞中的能量消耗[2]。UCP1和UCP2在机体产热中起重要作用。UCP2普遍存在于人类及鼠类的心、肾、肺、淋巴细胞、WAT、骨骼肌、脾、胸腺、巨噬细胞、骨髓、枯否氏细胞、白细胞等多种组织、细胞中, 尤在WAT中含量最多，分布部位和广泛性提示其在能量平衡、体重和热量调节及炎症刺激反应方面都有意义。本实验结果显示UCP2 mRNA的表达水平随着低氧时间的延长逐渐降低，且低氧30天时降低最明显。GrosfeldA等将离体的人PAZ6细胞置于低氧(6%O2)环境中培养48 h后,采用半定量的RT-PCR方法,发现细胞中UCP2 mRNA表达水平明显降低[3]。李云凤等将大鼠置于模拟海拔4000 m的低氧氧舱中(每天8 h，采用半定量的RT-PCR方法测定，21天后WAT中的UCP2 mRNA的表达水平明显降低[4]。本实验结果与上述结果相似。研究证明急性低氧暴露会引起体重下降[5，6]。而UCP2 mRNA表达降低可使机体能量消耗及产热减少，避免体重降低，是机体适应低氧环境的积极作用。 通过UCP2 mRNA与血红蛋白的相关性分析显示，两者呈一定负相关关系，即随着血红蛋白值的升高，UCP2的表达水平降低。两者的变化都是由低氧引起的。低氧时血氧容量增加，血液的运氧能力加强，而UCP2 mRNA的降低使线粒体氧化磷酸化代偿性增加，这种反应对降低机体的消耗，贮存机体能量以更好地适应高原低氧环境可能产生重要的作用。故UCP2 mRNA表达的降低和血红蛋白的升高都是适应低氧环境的一种自身保护性反应。 【参考文献】 [2] Masaki T,Yoshimatsu H,Chiba S,et al. Tumor necrosis factor a regulated in vivo expression of the rat UCP family differentially[J].Biochem Biophys Acta, 1999, 1436(3): 585-592 [3]Grosfeld A, Zilberfarb V, Turban S, et al. Hypoxia increases leptin expression in human PAZ6 adipose cells[J]. Diabetologia, 2002, 45(4): 527-530 [4] 李云凤，高继东，卢承德，等.间歇性低氧对大鼠解偶联蛋白2基因表达的影响[J].青海医学院学报,2006，27(4)：244-247 [5]YiLina,Keishi Kubo,Ge Rili,et al. The effect of exposure to norm baric hypoxia on the bodyweight in rats[J].青海医学院学报, 2005, 26(3): 153-155 [6]Tschop M,Morrison KM.Weight loss at high altitude[J].Adv Exp Med Bio ,2001, 502: 237-247 |