模拟失重骨细胞条件培养基对成骨细胞活性的影响

作者：孟芮，续惠云，王 哲，张 维，商 澎    作者单位：(西北工业大学生命科学院 空间生物实验模拟技术国防重点学科实验室，西北工业大学特殊环境生物物理学研究所，陕西西安 710072)

【摘要】  目的 探讨三维随机回转模拟失重培养后的骨细胞条件培养基(RCM)对成骨细胞活性的调节作用。方法 采用三维随机回转模拟失重培养小鼠骨细胞系MLOY4 48 h后，收集回转条件培养基(RCM)和未回转对照组的条件培养基(CCM)，用四甲基偶氮唑盐比色(MTT)法、对硝基苯磷酸(pNPP)法和流式细胞术(FCM)检测RCM对小鼠成骨样细胞系MC3T3E1增殖、周期及细胞分泌碱性磷酸酶(ALP)活性的影响。 结果 三维随机回转48 h后的MLOY4 RCM可促进MC3T3E1增殖，用100%的MLOY4 RCM和CCM培养MC3T3E1 48 h和72 h后， RCM组比CCM组分别增加了1.21和1.27倍，差异性极显著(P<0.001);周期检测结果表明，RCM可以使MC3T3E1越过周期阻滞点(S期);MC3T3E1的ALP活性在RCM组和CCM组之间无差异。 结论 三维随机回转模拟失重培养骨细胞48 h后的条件培养基促进了成骨细胞的增殖;并使成骨细胞的周期越过阻滞点，对成骨细胞的ALP活性无影响。

【关键词】  失重模拟;条件培养基;骨细胞;成骨细胞;细胞增殖;细胞周期;ALP活性

Effects of Conditioned Medium of Osteocytes Subjected to Simulated Weightlessness on Activity of Osteoblasts.MENG Rui, XU Huiyun，WANG Zhe, ZHANG Wei, SHANG Peng.Space Medicine & Medical Engineering,2009,22(4):247～251

　　Abstract: Objective To investigate the regulating effects of conditioned medium of rotation (RCM) of osteocytes subjected to simulated weightlessness on osteoblasts. Methods Conditioned medium of mouse osteocytelike cell line MLOY4 was subjected to simulated weightlessness for 48 h with rondom positioning machine (RPM).Its effects on proliferation, cell cycle and ALP activity of MC3T3E1 were tested with MTT(methyl thiazolyl tetrazolium), pNPP(pNitrophenyl Phosphate ) and flow cytometry respectively and compared with the effect of conditioned medium of control(CCM) which was not subjected to simulated weightlessness. Results After MC3T3E1 were cultured for 48 h and 72 h，100% conditioned medium of rotation (RCM) of MLOY4 after simulated weightlessness for 48 h significantly stimulated proliferation of MC3T3E1 cells as compared with conditioned medium of control (CCM).The rate of proliferation in RCM was 1.21 and 1.27 fold as compared wtih CCM, respectively(P<0.001). In cell cycle assay RCM made MC3T3E1 to overcome cell cycle arrest of S phase. There was no difference between RCM and CCM on ALP activity of MC3T3E1 cells. Conclusion After 48 h simulated weightlessness, RCM of osteocytes promotes proliferation of osteoblasts and makes osteoblasts to overcome cell cycle arrest. There is no effects of RCM of osteocytes on ALP activity of osteoblasts.

　　Key words:weightlessness simulation; conditioned medium;osteocytes; osteoblasts; cell proliferation; cell cycle; ALP activity

　　Address reprint requests to：SHANG Peng. Key Laboratory For Space Bioscience and Biotechnology, Institute of Special Environmental Biophysics, Faculty of Life Sciences, Northwestern Polytechnical University, Xi’an 710072, China

　　在中长期航天中，航天员面临的最主要健康问题是失重引起的骨丢失[1]。造成这种骨丢失的原因一般认为是由于缺乏力学负荷而使骨形成减少，骨吸收增加，最终导致骨的适应性重建过程失衡，但其确切的机制目前还不清楚。正常形态和功能的动态过程，其中骨细胞在调节骨重建中起了关键作用[2]。这是因为，骨细胞是骨组织中机械应力的主要感受器，它可以将感受到的机械应力转化为生化信号并传递到效应细胞(成骨细胞和破骨细胞)，调节骨的适应性重建[3]。骨细胞调节效应细胞的方式有两种，一是通过释放可溶性因子调节效应细胞，二是通过细胞间的间隙连接通讯将信号传递到效应细胞。研究表明，骨细胞遭受力学刺激后的条件培养基不仅可以调节成骨细胞的增殖和分化活性[45]，而且也可以调节破骨前身细胞向破骨细胞分化活性[6]。进一步研究证明，骨细胞遭受力学刺激后的条件培养基对效应细胞的调控作用是骨组织细胞中特有的，其它骨组织细胞如骨膜成纤维细胞和成骨细胞遭受力学刺激后的条件培养基对效应细胞的调节作用远远小于骨细胞[4]。Vezeridis等[4]研究表明，分离的原代鸡胚颅骨骨细胞遭受脉动性的流体刺激后，其条件培养基抑制了成骨细胞的增殖，并且通过增加ALP活性促进了成骨细胞分化。本实验通过三维随机回转仪模拟失重，研究骨细胞在模拟失重后是否可以通过分泌可溶性因子调节成骨细胞的活性，旨在探讨模拟失重条件下骨细胞对其效应细胞(成骨细胞)活性的调节机制，为阐明失重性骨丢失机制提供依据。

　　方 法

　　实验材料

　　MEM培养基、FBS血清、BCS血清购自Hyclone公司，I型鼠尾胶原购自美国BD公司，骨细胞系MLOY4由美国德克萨斯大学Bonewold教授惠赠。小鼠成骨细胞系MC3T3E1购自美国ATCC细胞库。三维随机回转仪由中国科学院空间科学与应用研究中心研制，流式细胞仪为美国BD公司FACS Calibur。CO2培养箱为德国Heraeus公司HERA cell 150。

　　细胞培养

　　骨细胞系MLOY4采用MEM基本培养基，添加5%的胎牛血清(FBS)和 5%的小牛血清(BCS)进行培养，细胞生长在I型鼠尾胶原(50 μg/mL)包被过的培养瓶中以维持性状。成骨样细胞系MC3T3E1采用MEM基本培养基，添加10%的FBS进行培养。

　　三维回转器及模拟失重培养

　　三维随机回转器的原理是基于重力矢量平均，即在回转过程中，细胞的方向不断发生变化，地球引力这一矢量在回转一圈过程中矢量和为零。同时细胞还会受到一定的惯性力，因此细胞在回转过程中所受到的残余重力可通过公式g0 = ω2r/g来计算，其中g0: 残余重力;ω:回转加速度;r:回转半径; g：重力加速度。根据此公式，三维回转器的转速在10 r/min以下均可实现10-3g[7], 本实验中通过不同转速筛选结果表明，在10 r/min以内，转速过低效应不明显，过高时会引起细胞的脱落，因此本实验采用8 r/min的转速。

　　MLOY4细胞以1×105 /瓶接种到I型鼠尾胶原包被过的培养瓶(20 mL/瓶)中，37 ℃，5%CO2培养箱中培养24 h使其完全贴壁后，瓶中灌满培养基，排出气泡，封口膜密封，随机分成2组。一组放置在三维随机回转仪上，并把三维随机回转仪放置在培养箱中，进行恒速(8 r/min)回转模拟失重培养，另一组放置在培养箱内正常生长作为对照。

　　骨细胞条件培养基的收集

　　三维随机回转模拟失重48 h后，收集MLOY4条件培养基(RCM)和未回转的对照条件培养基(CCM)上清，于1 500 r/min离心20 min，0.22 μm的滤膜过滤，在2周内置4 ℃备用，长时间置-80 ℃存放。同时以不含条件培养基的新鲜MEM培养基(NM)作为RCM和CCM的对照。

　　骨细胞条件培养基对成骨细胞增殖的影响

　　采用新鲜MEM基本培养基分别把RCM和CCM稀释为以下浓度：0、20%、50%、80%和100%，分别添加10%的FBS。MC3T3E1细胞分别以1×103、1.5×103、3×103和1×104 /孔接种到96孔板中贴壁培养24 h后，更换以上稀释的不同浓度的条件培养基，培养24 h、48 h和72 h 后采用MTT法检测增殖情况，重复3次。

　　骨细胞条件培养基对成骨细胞周期的影响

　　MC3T3E1以5×105 /瓶接种到100 mL培养瓶中，培养24 h使其完全贴壁后，更换无血清MEM培养基，血清饥饿48 h使细胞同步化。同步化处理后的细胞以10 mL/瓶更换100%的RCM和CCM，并以NM为对照，分别添加10%FBS。分别培养24 h、48 h和72 h后流式细胞仪检测细胞周期分布。细胞周期检测方法为：每组各取3瓶细胞，胰蛋白酶消化后收集细胞计数，并于1 000 r/min 离心8 min收集细胞，2 mL PBS洗涤细胞2次(离心1 000 r/min，5 min)，弃上清，加入1 mL 70%的冰乙醇，混匀后置-20 ℃保存。流式细胞仪检测时，细胞离心，弃去冰乙醇，以1×106细胞加入1 mL DNA低渗缓冲液，4 ℃避光染色30 min, 在1 h内检测细胞周期。实验重复3次。

　　骨细胞条件培养基对成骨细胞ALP活性的影响

　　采用新鲜MEM基本培养基分别把RCM和CCM稀释为50%和100%，并以NM为对照，添加10%的FBS。MC3T3E1细胞分别以3×103、6×103、9×103和1×104/孔接种到96孔板中培养24 h后， 更换以上稀释好的条件培养基，培养24 h、48 h和72 h后，收集上清，采用PNPP法[4]检测MC3T3E1细胞分泌ALP的活性。

　　统计分析

　　用Prism软件进行统计分析，分别以t检验比较骨细胞系MLOY4 RCM和CCM对成骨样细胞系MC3T3E1增殖和周期的影响。P<0.05为差异显著。

　　结 果

　　模拟失重培养的MLOY4条件培养基对MC3T3E1增殖的影响

　　图1所示,100% MLOY4条件培养基培养MC3T3E1 48 h和72 h后， RCM组的MC3T3E1增殖较CCM组分别增加了1.21和1.27倍，差异极显著(P<0.001);80%的MLOY4条件培养基分别培养MC3T3E1 24 h和72 h后，RCM组比CCM组分别增加了1.20和1.12倍，差异显著(P<0.01，P<0.05)。

　　从图1还可看出，RCM组和CCM组的MC3T3E1增殖均略高于NM组，但是，培养72 h 后，CCM组随着条件培养基浓度的升高，对MC3T3E1增殖的抑制作用越明显，而RCM组可以逆转这种抑制效应，甚至略高于NM组。

　　模拟失重培养的MLOY4条件培养基对MC3T3E1 周期的影响

　　MC3T3E1细胞血清饥饿48 h后，周期检测结果表明，MC3T3E1的周期有87.43%阻滞在G0/G1期，G2/M期细胞为0，表明可用于细胞周期同步化处理。MLOY4条件培养基对MC3T3E1周期的影响见表1，100%的MLOY4 RCM、CCM和NM培养MC3T3E1 24 h、48 h和72 h后，RCM组与CCM组相比，CCM组的G2/M期细胞比例明显减少，而S期细胞比例增多，表明骨细胞条件培养基对成骨细胞的周期调节是一种负调控机制，并且调控点在S期，而RCM可以使MC3T3E1越过S期周期阻滞点，从而接近NM组。

　　模拟失重培养的MLOY4条件培养基对MC3T3E1 ALP活性的影响

　　MLOY4 条件培养基培养M3T3E1 24 h，48 h和72 h后，无论是不同接种密度(3×103、6×103、9×103)的MC3T3E1(图2)，还是不同浓度(50%和100%)的MLOY4条件培养基(图2,3)，RCM组和CCM组之间均没有显著性差异，即对MC3T3E1的ALP活性没有影响。　表1 模拟失重培养的MLOY4条件培养基(100%)对MC3T3E1细胞周期的影响

　　讨 论

　　航天失重环境引起的骨丢失是航天员面临的主要健康威胁之一。有关失重引起的骨丢失机制已有较多研究，大多认为是由于成骨功能降低和/或破骨吸收功能增加所致[8]。骨细胞作为骨组织多细胞间主要的力学感受枢纽，不仅感受力学刺激，而且可以将感受到的力学刺激转化为生化信号并传递到效应细胞，从而调节骨的适应性重建。因此，骨细胞可能作为失重或者去负荷的主要感受器，在失重引起的骨丢失机制中起着重要作用。

　　本研究采用三维回转器，又称随机定位仪(random positioning machine, RPM)，具有两个独立的相互垂直的转轴，分别驱动外框和内框。内外框的转动速度和方向由程序控制，它们的转动引起细胞在三维水平不断改变方向，从而可以使重力矢量平均而达到模拟航天失重效应。根据残余重力的公式[7]可知，回转样品所受到的力与转速和回转半径有关。因此，为了获得与空间失重环境下10-3g相当的重力，在半径和角速度一定的情况下，可计算出所需的转速。本研究中在10 r/min转速下均可达到此重力水平。通过不同转速的细胞实验结果表明，转速过低时效应不明显，转速过高容易引起细胞脱落，在8 r/min较适宜于骨细胞的培养。Pardo等[9]采用Fokker空间公司研制的随机定位仪(RPM)培养前成骨细胞2T3，结果表明三维回转模拟失重抑制了前成骨细胞分化，并且改变了其基因表达谱。Kraft等[10]认为，随机定位仪可以比二维回转器更好地模拟失重效应。

　　骨细胞在应答机械信号时突触延长，并释放可溶性因子(如PGE2，ATP和NO)[1113]，这些可溶性因子可以调节成骨细胞的功能。Bonewald等[3]研究了分离的原代鸡胚颅骨骨细胞、成骨细胞和骨膜成纤维细胞遭受流体剪切力后的条件培养基对成骨细胞增殖的影响，结果表明，与成骨细胞和骨膜成纤维细胞的条件培养基相比，骨细胞的条件培养基明显抑制了成骨细胞的增殖。骨细胞模拟失重后的条件培养基对成骨细胞增殖的调节尚未见报道，本研究采用三维回转模拟失重后的骨细胞条件培养基培养成骨细胞，结果表明，无论是MC3T3E1不同的接种密度(文中未显示)，还是不同的骨细胞条件培养基浓度，三维回转后高浓度的条件培养基(RCM)(80%和100%)与CCM相比均促进了成骨细胞的增殖。结果还表明，RCM组接近正常培养(NM)的MC3T3E1的增殖情况，甚至略高，这可能是骨细胞在模拟失重后的一种应激反应，通过启动应激反应，使成骨细胞的增殖接近正常状况，以抵抗失重引起的骨丢失。因此可以推测，骨细胞可能通过自分泌或者旁分泌的方式，调节了成骨细胞的增殖活性，在正常条件下，分泌某种可溶性因子，控制成骨细胞的增殖，从而使骨重建处于平衡状态，而在模拟失重后，骨细胞可能会将感受到的失重信号转化为生化信号，通过分泌某些可溶性因子将信号传递到效应细胞(成骨细胞)，调节成骨细胞的增殖，从而使骨重建达到一种新的平衡。

　　研究表明，成骨细胞直接暴露在失重条件下会出现周期阻滞现象。张晓铀等[15]发现成骨细胞OS732回转器模拟失重后细胞周期阻滞在G0/G1期。王攀等[16]研究表明，人成骨骨肉瘤细胞MG63细胞采用回转器模拟失重后，细胞在S期有阻滞现象。这些实验均为成骨细胞直接暴露于模拟失重条件下的研究结果，然而，骨重建是一个多细胞间相互调节的过程，研究模拟失重下多细胞间的相互调节可以更加接近体内真实状况。本研究采用三维随机回转器模拟失重培养的骨细胞条件培养基培养成骨细胞，探讨模拟失重条件下骨细胞对成骨细胞活性的调节作用。细胞周期检测结果表明，骨细胞CM培养MC3T3E1细胞24 h、48 h和72 h后，RCM组与CCM组相比，G0/G1期细胞无明显变化，G2/M期细胞多于CCM组，S期细胞明显少于CCM组，表明RCM可以使成骨细胞越过周期阻滞点，这个结果与增殖实验结果一致，证实三维随机回转确实可以促进成骨细胞的增殖。因此可以推测骨细胞可能通过某种可溶性因子调节成骨细胞的增殖及周期，而周期的调控点可能就在S期，三维随机回转模拟失重可能触发了骨细胞对失重的应答，随后通过分泌某种可溶性因子或者改变其分泌量，使成骨细胞越过阻滞点，从而通过促进增殖对抗骨形成降低。

　　有关骨细胞条件培养基对成骨细胞ALP活性的影响报道不尽一致。张等[14]研究表明，骨细胞遭受流体剪切力后的条件培养基明显促进了成骨细胞的ALP活性，但是Talor等[5]研究表明，骨细胞与成骨细胞共培养时，骨细胞遭受流体剪切力可以促进成骨细胞的ALP活性，而当阻断骨细胞与成骨细胞的间隙连接通讯(GJIC)后就不会促进成骨细胞的ALP活性。GJIC及间隙连接蛋白(CX43)参与成骨细胞的分化成熟和功能表达[17]。本研究结果与Talor的研究结果一致，无论采用不同的成骨细胞接种密度，还是采用不同浓度的骨细胞条件培养基，骨细胞三维回转模拟失重后对MC3T3E1的ALP活性均没有影响。因此，骨细胞对成骨细胞的分化可能只是通过细胞与细胞之间直接相互作用(GJIC)来调节。

　　本研究的结果表明，骨细胞可以通过分泌某些可溶性因子调节成骨细胞的增殖和周期，从而调节骨重建活性。骨细胞除了对力学刺激敏感外，还对失重敏感，模拟失重后，骨细胞会启动应急反应，通过释放某种可溶性因子调节成骨细胞的增殖活性以对抗失重。骨细胞对成骨细胞的功能调节是多方面的复杂过程，而不仅仅是通过释放某种因子调节，骨细胞与成骨细胞之间的间隙连接也是细胞间通讯的一种重要方式，综合这些研究，将为阐明失重引起的骨丢失机制提供依据。

　　(致谢:特别感谢美国德克萨斯大学Bonewald教授惠赠骨细胞系MLOY4，感谢西北工业大学特殊环境生物物理学研究所骞爱荣副教授，狄升蒙、杨鹏飞、胡丽芳、瓮媛媛等同学的大力支持与帮助。)

【参考文献】
  　[1] Lang TF. What do we know about fracture risk in longduration spaceflight[J]? J Musculoskelet Neuronal Interact,2006,6(4):319321.

　　[2] MENG Rui,WANG Haifang,XU Huiyun,et al. Progress in function of osteocyte[J]. Chinese Journal of Cell Biology,2008,30(2):161165.

　　[3] Bonewald LF, Johnson ML. Osteocytes, mechanosensing and Wnt signaling[J]. Bone,2008,42 (4): 606615.

　　[4] Vezeridis PS, Semeins CM, Chen Q, et al. Osteocytes subjected to pulsating fluid flow regulate osteoblast proliferation and differentiation[J]. BBRC,2006,348(3):10821088.

　　[5] Taylor AF, Saunders MM, Shingle DL, et al. Mechanically stimulated osteocytes regulate osteoblastic acivity via gap junctions[J]. Am J Physiol,2007,292(1):C545552.

　　[6] You L, Temiyasathit S, Lee P, et al. Osteocytes as mechanosensors in the inhibition of bone resorption due to mechanical loading[J]. Bone， 2008,42(1):172179.

　　[7] van Loon JJWA. Some history and use of the random positioning machine, RPM, in gravity related research[J]. Advances in Space Research, 2007,39(7): 11611165.

　　[8] Carmeliet G, Vico L, Bouillon R. Space flight: a challenge for normal bone homeostasis[J]. Crit Rev Eukaryot Gene Expr, 2001,11(13):131144.

　　[9] Pardo SJ, Patel MJ, Sykes MC, et al. Simulated microgravity using the random positioning machine inhibits differentiation and alters gene expression profiles of 2T3 preosteoblasts[J]. Am J Physiol Cell Physiol, 2005,288(6):12111221.

　　[10] Kraft TFB, van Loon JJWA, Kiss JZ. Plastid position in Arabidopsis columella cells is similar in microgravity and on a randompositioning machine[J]. Planta, 2000,211(3):415422.

　　[11] Cheng B, Kato Y, Zhao S, et al. PGE(2) is essential for gap junctionmediated intercellular communication between osteocytelike MLOY4 cells in response to mechanical strain[J]. Endocrinology,2001,142: 34643473.

　　[12] Cherian PP, SillerJackson AJ, Gu S, et al. Mechanical strain opens connexin 43 hemichannels in osteocytes: a novel mechanism for the release of prostaglandin[J]. Mol Biol Cell,2005,16: 31003106.

　　[13] Kephart CJ, Genetos DC, Doanhue HJ. Fluid flow activation of gap junction hemichannels and ATP release in MLOY4 osteocytes requires PKC activation[C]. 51st Ann Meet ORS Trans Vol 2005,30: 0144.

　　[14] ZHANG Xiaoyou, WANG Gong zhi, DING Bai, et al. Effects of simulated weightlessness on cell cycle of ostoeblastlike cells[J]. Chin J Aerospace Med, 2001,11(1):4345.

　　[15] WANG Pan, ZHANG Shu, WANG Bing, et al. Effects of simulated weightlessness on cellular morphology[J]. Space Medicine & Medical Engineering, 2007,20(6):406409.

　　[16] Civitelli R. Cellcell communication in the osteoblast/osteocyte lineage[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics,2008,473:188192.