大黄蛰虫丸对大鼠肝星状细胞活化增殖的影响

作者：潘志恒， 成家茂， 李永伟， 何宏文， 谢瑶， 何义华    作者单位：１． 中山大学附属第三医院中医科， 广东 广州 ５１０６３０； ２． 大理医学院人体解剖学教研室， 云南 大理 ６７１０００；３． 中山大学人体解剖学教研室， 广东 广州 ５１００８０

【摘要】  【目的】 观察大黄蛰虫丸对经旁分泌和自分泌途径激活大鼠肝星状细胞活化增殖情况的影响。【方法】 采用Ｎｙｃｏｄｅｎｚ 分离液非连续密度梯度离心法同步分离急性ＣＣｌ４ 损伤模型大鼠和正常大鼠肝的枯否细胞（ＫＣ）和星状细胞（ＨＳＣ）。在制备正常鼠血清和ＤＨＺＣＷ药物血清的基础上，将它们分别加入ＫＣ和ＨＳＣ培养板内作用后制备成正常鼠ＫＣ条件培养液（ＮＫＣＣＭ）、损伤鼠ＫＣ条件培养液（ＫＣＣＭ）以及正常鼠ＨＳＣ条件培养液（ＨＳＣＣＭ）。将上述条件培养液分别干预ＨＳＣ ２４ ｈ、４８ ｈ和７２ ｈ，然后采用ＭＴＴ法和３Ｈ-ＴｄＲ掺入法分别检测比较各组ＨＳＣ细胞活化增殖情况。 【结果】 损伤鼠不含药组和正常ＫＣ对照组比较，ＨＳＣ活化增殖情况显著性增高（Ｐ ＜ ０．０１），损伤鼠含药组ＨＳＣ活化增殖则显著降低（Ｐ ＜ ０．０１，Ｐ ＜ ０．０５），且其抑制效应随着含药血清浓度的升高逐渐增强；而正常鼠ＨＳＣ不含药组和正常鼠ＨＳＣ含药组各组间比较均无显著性差异（均Ｐ ＞ ０．０５）。 【结论】 ＤＨＺＣＷ对经旁分泌途径激活大鼠ＨＳＣ活化增殖有明显的抑制作用，且作用效应与血清药物浓度间存在剂量依赖关系，但对经自分泌途径激活大鼠ＨＳＣ活化增殖未见明显抑制作用。

【关键词】  大黄蛰虫丸； 旁分泌； 自分泌； 肝星状细胞； 增殖

    Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｄａｈｕａｎｇ Ｚｈｅｃｈｏｎｇ Ｐｉｌｌ ｏｎ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒａｔ Ｈｅｐａｔｉｃ Ｓｔｅｌｌａｔｅ Ｃｅｌｌｓ

    ＰＡＮ Ｚｈｉ-ｈｅｎｇ１， ＣＨＥＮＧ Ｊｉａ-ｍａｏ２， ＬＩ Ｙｏｎｇ-ｗｅｉ１， ＨＥ Ｈｏｎｇ-ｗｅｎ３， ＸＩＥ Ｙａｏ３， ＨＥ Ｙｉ-ｈｕａ１

    （１． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｔｈｅ Ｔｈｉｒｄ Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ， ＳＵＮ Ｙａｔ-ｓｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０６３０， Ｃｈｉｎａ； ２． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｎａｔｏｍｙ， Ｄａｌｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｄａｌｉ ６７１０００， Ｃｈｉｎａ； ３． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｎａｔｏｍｙ， ＳＵＮ Ｙａｔ-ｓｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１００８０， Ｃｈｉｎａ）

    Ａｂｓｔｒａｃｔ： 【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】 Ｔｏ ｏｂｓｅｒｖｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｄａｈｕａｎｇ Ｚｈｅｃｈｏｎｇ Ｐｉｌｌ （ＤＨＺＣＷ） ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｔ ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅｌｌａｔｅ ｃｅｌｌｓ （ＨＳＣｓ） ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｂｙ ｐａｒａｃｒｉｎｅ ａｎｄ ａｕｔｏｃｒｉｎｅ ｐａｔｈｗａｙ． 【Ｍｅｔｈｏｄｓ】 Ｔｈｅ ＣＣｌ４-ｉｎｊｕｒｅｄ ａｎｄ ｎｏｒｍａｌ ｒａｔ Ｋｕｐｆｆｅｒ ｃｅｌｌｓ （ＫＣ）， ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅｌｌａｔｅ ｃｅｌｌｓ （ＨＳＣ） ｗｅｒｅ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｂｙ ｎｏｎ-ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｄｅｎｓｉｔｙ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｙｃｏｄｅｎｚ ｍｅｄｉｕｍ． Ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｃｏｍｍｏｎ ｒａｔ ａｎｄ ＤＨＺＣＷ ｄｒｕｇ ｓｅｒａ ｗｅｒｅ ｐｒｅｐａｒｅｄ， ｔｈｅｙ ｗｅｒｅ ａｄｄｅｄ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ｉｎｔｏ ＫＣ ａｎｄ ＨＳＣ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅｓ ｆｏｒ ｎｏｒｍａｌ ＫＣ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ （ＮＫＣＣＭ）， ｉｎｊｕｒｅｄ ｒａｔ ＫＣ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ （ＫＣＣＭ） ａｎｄ ＨＳＣ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ （ＨＳＣＣＭ）． Ａｆｔｅｒ ＨＳＣｓ ｗｅｒｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｄ ｆｏｒ ２４， ４８ ａｎｄ ７２ ｈ ｂｙ ｔｈｏｓｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉａ， ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ＨＳＣｓ ｉｎ ａｌｌ ｇｒｏｕｐｓ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｍｅｔｈｙｌ ｔｈｉａｚｏｌｙｌ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ （ＭＴＴ） ａｎｄ ３Ｈ-ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ （３Ｈ-ＴｄＲ） ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ． 【Ｒｅｓｕｌｔｓ】 Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ＨＳＣＣＭ ｇｒｏｕｐ， ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＨＳＣｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｍａｒｋｅｄｌｙ ｉｎ ＫＣＣＭ ｗｉｔｈｏｕｔ ｄｒｕｇ ｇｒｏｕｐ （Ｐ ＜ ０．０１）． Ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＨＳＣ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｉｎ ＫＣＣＭ ｗｉｔｈ ｄｒｕｇ ｇｒｏｕｐ （Ｐ ＜ ０．０５） ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｓ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｒａ ｗｉｔｈ ｄｒｕｇ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ． Ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ＨＳＣＣＭ ｗｉｔｈｏｕｔ ｄｒｕｇ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ＨＳＣＣＭ ｗｉｔｈ ｄｒｕｇ ｇｒｏｕｐ （Ｐ ＞ ０．０５）． 【Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ】 ＤＨＺＣＷ ｃａｎ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｔ ＨＳＣｓ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｂｙ ｐａｒａｃｒｉｎｅ ｐａｔｈｗａｙ， ａｎｄ ｔｈｅｒｅ ｉｓ ａ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ-ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ ａｎｄ ｔｈｅ ｄｒｕｇ ｄｏｓｅ． Ｈｏｗｅｖｅｒ， ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｎｏ ｒｅｍａｒｋａｂｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｔ ＨＳＣｓ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｂｙ ａｕｔｏｃｒｉｎｅ ｐａｔｈｗａｙ．          

    Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｄａｈｕａｎｇ Ｚｈｅｃｈｏｎｇ ｐｉｌｌ； ｐａｒａｃｒｉｎｅ ｐａｔｈｗａｙ； ａｕｔｏｃｒｉｎｅ ｐａｔｈｗａｙ； ｌｉｖｅｒ ｓｔｅｌｌａｔｅ ｃｅｌｌ； ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ

    肝纤维化发生的机制虽然十分复杂，但肝星状细胞（ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅｌｌａｔｅ ｃｅｌｌ， ＨＳＣ）在肝损伤过程中被激活经表型转化成肌成纤维细胞（ｍｙｏ-ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｅｒ，ＭＦＢ），产生大量细胞外基质（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ，ＥＣＭ）毫无疑问是肝纤维化形成的中心环节［１－２］。慢性肝损伤时，与ＨＳＣ相邻的枯否（ＫＣ）细胞首先被激活，活化的ＫＣ吞噬毒素与大量分泌炎性细胞因子，后者以旁分泌途径刺激ＨＳＣ活化增殖并转化为ＭＦＢ，并通过分泌转化生长因子（ＴＧＦβ１） 等重要细胞因子进一步维持自身的激活状态并激活邻近的ＨＳＣ［３］。因此研究具有抗肝纤维化作用的中药复方药物血清对大鼠经旁分泌和自分泌途径激活ＨＳＣ细胞活化增殖情况的影响意义重大。本课题组以往的研究工作发现，经方大黄蛰虫丸（ＤＨＺＣＷ）对体外培养的传代ＨＳＣ活化增殖有直接的抑制作用，但具体作用机制不明［４］。为了进一步探讨该药的抗肝纤维化作用机制，我们观察了ＤＨＺＣＷ对大鼠旁分泌途径和旁分泌途径激活ＨＳＣ细胞活化增殖的影响。

    １ 材料和方法

    １．１　材 料

    １．１．１ 动 物 雄性Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）大鼠，ＳＰＦ 级，体质量４００ ～ ５００ ｇ，均由中山大学药学院实验动物中心提供，普通饲料和普通饮水饲养。实验前禁食１２ ｈ。

    １．１．２ ＨＳＣ细胞株 由北京大学人民医院肝胆外科中心魏玉华老师惠赠。

    １．１．３ 药 物 大黄蛰虫丸药粉为暗紫色粉末，由广东阳江制药厂惠赠。

    １．１．４ 主要试剂和仪器 链霉蛋白酶Ｅ（ｐｒｏｎａｓｅ Ｅ）、Ⅳ型胶原酶（ｔｙｐｅ Ⅳｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）、ＤＮａｓｅ Ｉ、胰蛋白酶（ｔｒｙｐｓｉｎｅ）、Ｎｙｃｏｄｅｎｚ 原液、噻唑蓝（ＭＴＴ）均购自Ｓｉｇｍａ 公司；四氯化碳（ＣＣＬ４）、高纯度琼脂糖、核酸染料等生化试剂购自上海生物工程有限公司；Ｍ１９９ 培养液（标准型）、ＤＭＥＭ 干粉均购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 公司产品；标准胎牛血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ，ＦＢＳ）购自杭州四季青生物制品公司；氚－胸腺嘧啶核苷（３Ｈ-ＴｄＲ）购自中国科学院上海原子核研究所等。

    ＯＬＹＭＰＵＳ ＣＸ３１型倒置相差显微镜（ＯＬＹＭＰＵＳ公司）；Ｈｅｒａｅｕｓ Ｂｉｏｆｕｇｅ １５Ｒ型台式高速冷冻离心机（德国Ｈｅｒａｅｕｓ公司）；ＦＪ-２１１Ｇ双道液体闪烁仪（西安二六二厂产品）；Ｂｉｏ-Ｔｅｋ ＥＬ × ８００型全自动酶标仪（美国Ｂｉｏ-Ｔｅｋ公司产品）等。

    １．２　方 法

    １．２．１　含药血清及正常鼠血清的制备 参考文献［５］方法给予ＳＤ大鼠灌胃服用大黄蛰虫丸药粉（每只每天２．７ ｇ）。将上述药粉用超纯水溶解，每天分２次灌胃给药，每次４ ｍＬ，连续给药５ ｄ。空白对照组为正常大鼠组，灌胃等量超纯水。采血时间为末次灌胃后１ ｈ，以乙醚麻醉大鼠，无菌状态下打开大鼠心脏，经右心房抽血，２ ０００ ｒ／ｍｉｎ（ｒ ＝ １３．５ ｃｍ） 离心１５ ｍｉｎ，血清经５６ ℃灭活３０ ｍｉｎ 后置于 －２０ ℃冰箱内保存备用。

    １．２．２ 造模 采用ＳＤ雄性大鼠，皮下注射５００ ｍＬ／Ｌ ＣＣｌ４ ５ ｍＬ／ｋｇ （与植物油按１∶１比例混合），５ ｄ 后分离ＫＣ。

    １．２．３ ＫＣ的分离 参考文献［６］并改进，分离培养损伤模型鼠和正常鼠的ＫＣ，台盼蓝染色法检测细胞活性，碳素墨汁吞噬实验鉴定细胞。正常大鼠的细胞得率为（０．５ ～ １．０） × １０７ ／肝，损伤模型鼠的细胞得率为（１．０ ～ １．５） × １０７ ／肝，纯度均 ＞ ９０％。

    １．２．４ ＨＳＣ细胞株的培养 以５ × １０３ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２接种于５０ ｍＬ 培养瓶内，加入含１００ ｍＬ／Ｌ ＦＢＳ 的Ｍ１９９ 培养液，每３ ｄ 左右铺满单层后传代。

    １．２．５ 条件培养液（ＣＭ）制备 正常鼠ＫＣ 条件培养液（ＮＫＣＣＭ）的制备参考文献［７］并改进。ＫＣ 以１ × １０５ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２ 密度接种于６ 孔培养板，培养４８ ｈ 后吸弃培养液，再加入含２００ ｍＬ／Ｌ 正常鼠血清的ＤＭＥＭ 培养液３ ｍＬ 继续培养，２４ ｈ 后收集上清液，记为ＮＫＣＣＭ。同样方法４８ ｈ 后再收集１次，两次的ＮＫＣＣＭ 混合，置于 －７０ ℃ 冰箱中保存备用。损伤鼠ＫＣ 条件培养液（ＫＣＣＭ）的制备方法同上，但加入的血清为药物血清，体积分数分别为含０％（０％药物血清 ＋ ２０％正常鼠血清）、５％（５％药物血清 ＋ １５％正常鼠血清）、１０％（１０％药物血清 ＋ １０％正常鼠血清）和２０％ （２０％ 药物血清，无正常鼠血清），收集的上清液分别记为０％、５％、１０％和２０％ ＫＣＣＭ。（３）正常鼠ＨＳＣ条件培养液（ＨＳＣＣＭ）的制备：与ＫＣ同步分离获得ＨＳＣ，细胞以１ × １０４ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２密度接种于含１００ ｍＬ／Ｌ胎牛血清的Ｍ１９９培养液中贴壁培养。方法同上，分别制备成０％、５％、１０％、２０％含药ＨＳＣ条件培养液（ＨＳＣＣＭ）。

    １．２．６ 实验分组 ① 对照组：将ＨＳＣ 细胞株接种于培养板培养２４ ｈ 后，弃去培养液，加入ＮＫＣＣＭ，作用于ＨＳＣ ２４ ｈ后即可检测。② 旁分泌组：包括０％、５％、１０％、２０％  ＫＣＣＭ组共四组。加入ＣＭ方法同对照组。③ 自分泌组：包括０％、５％、１０％、２０％ＨＳＣＣＭ组共４组。同上方法接种细胞后弃培养液，分别加入不同的条件培养液制备而成，继续培养２４ ｈ、４８ ｈ或７２ ｈ后分别进行ＨＳＣ活性的检测。

    １．２．７ 活化ＨＳＣ增殖的检测 采用ＭＴＴ法和３Ｈ-ＴｄＲ掺入法检测。ＭＴＴ 法：称取１２５ ｍｇ ＭＴＴ放入小烧杯中，加２５ ｍＬ ＰＢＳ（０．０１ ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ７．４）搅拌，将铺满单层的ＨＳＣ用２．５ ｇ／Ｌ胰酶消化后，以１０３ ｃｅｌｌｓ ／孔密度接种于９６ 孔板中。培养２４ ｈ 后，吸弃上清，分别加入ＮＫＣＣＭ、０％、５％、１０％、２０％ ＫＣＣＭ和０％、５％、１０％、２０％ ＨＳＣＣＭ 各２００ μＬ（每组设３ 个复孔，用不同批次的ＣＭ重复实验３ 次）。每孔加入ＭＴＴ 溶液（５ ｍｇ／ｍＬ） ２０ ?滋Ｌ，孵育４ ｈ弃上清液，ＰＢＳ 洗涤，然后每孔加入２００ ?滋Ｌ ＤＭＳＯ。选择５７０ ｎｍ 波长，以酶标仪检测各孔ＯＤ值。 ３Ｈ-ＴｄＲ掺入法：将ＨＳＣ以１０４ ｃｅｌｌｓ ／孔密度接种于２４ 孔板中，培养２４ ｈ后吸弃培养液，再加入ＣＭ（方法同上）。培养至２０ ｈ 后，再每孔加入０．５ ?滋Ｃｉ／１００ ?滋Ｌ 的３Ｈ-ＴｄＲ，胰酶消化，洗涤，超速离心过滤后将细胞收集于玻璃纤维滤膜上，在６０ ℃ 恒温干燥箱内放置３０ ｍｉｎ 烘干，移至测量管内，用液闪计数仪测定每孔ＨＳＣ的放射活性即每分钟脉冲数值（ｃｐｍ值）。

    １．３ 数据分析

    各组数据均使用ｘ ± ｓ表示，多组计量资料均数比较采用方差分析，组间两两比较采用ＳＮＫ- ｑ检验。使用ＳＰＳＳ １３．０统计分析软件分析数据，α ＝ ０．０５。

    ２ 结 果

    ２．１ 原代分离培养ＫＣ、ＨＳＣ的形态和鉴定

    新分离的ＨＳＣ 倒置相差显微镜下呈圆形，内含高折光性颗粒。培养４ ～ ４８ ｈ大部分细胞已贴壁；１０ ～ １４ ｄ细胞渐融合，形态由星形向梭形转变，胞体变长，胞浆内脂滴减少，细胞呈局灶性簇状增殖生长，其间有大量新生细胞（图１Ａ）。细胞生长成单层铺满培养瓶后即可传代培养，传代后的细胞可呈成纤维细胞样改变（图１Ｂ）。

    新分离的ＫＣ 荧光显微镜下观察，在３２８ ｎｍ 波长处未见明显的细胞自发荧光现象，而ＨＳＣ的胞浆内呈现蓝绿色荧光。ＫＣ碳素墨汁吞噬试验２ ｈ后普通显微镜下胞浆内即可见大量吞噬的墨汁颗粒（图１Ｃ）。传代的ＨＳＣ α-ＳＭＡ 免疫细胞化学染色阳性细胞几乎达１００％（图１Ｄ）。

    ２．２ ＤＨＺＣＷ对经旁分泌途径活化ＨＳＣ细胞ＭＴＴ转化的影响

    旁分泌组和正常对照组条件培养液对活化的ＨＳＣ作用２４ ｈ、４８ ｈ、７２ ｈ后，测定各组的ＯＤ值（表１）。 可见，在对ＨＳＣ作用２４ ｈ、４８ ｈ、７２ ｈ后，旁分泌组的ＯＤ值随着含药血清浓度的升高而出现明显下降。旁分泌组中含药血清作用组和无药物血清作用组相比，５％ ＫＣＣＭ组、１０％ ＫＣＣＭ组与０％ ＫＣＣＭ组的组间差别有统计学意义（Ｐ ＜ ０．０５）；而２０％ ＫＣＣＭ组与０％ ＫＣＣＭ组的组间差别有显著统计学意义（Ｐ ＜ ０．０１）。旁分泌组和正常对照组相比，ＯＤ值均升高，除２０％ ＫＣＣＭ组和４８ ｈ的１０％ ＫＣＣＭ组与ＮＫＣＣＭ组间无明显差别外，其余组与ＮＫＣＣＭ组间的差别均有统计学意义（Ｐ ＜ ０．０５）。

    ２．２ ＤＨＺＣＷ对经自分泌途径活化的ＨＳＣ细胞ＭＴＴ转化的影响

    自分泌组条件培养液对活化的ＨＳＣ作用２４、４８、７２ ｈ后，测定各组的ＯＤ值（表２）。可见，自分泌组中无药物血清作用的０％ＨＳＣＣＭ组与其它含药血清作用的５％、１０％、２０％ ＨＳＣＣＭ组相比，及各含药血清作用组组间比较，ＯＤ值的变化无明显差别（Ｐ ＞ ０．０５）。

    ２．３ ＤＨＺＣＷ对经旁分泌途径活化ＨＳＣ细胞ＤＮＡ合成的影响

    旁分泌组和正常对照组条件培养液对活化的ＨＳＣ作用２４、４８、７２ ｈ后，测定各组的ｃｐｍ值（表３）。可知，对ＨＳＣ分别作用２４、４８、７２ ｈ后，随着含药血清浓度的升高，含药血清作用的５％、１０％ ＫＣＣＭ组ｃｐｍ值出现迅速升高，与无药血清作用的０％ ＫＣＣＭ组相比有明显差异（Ｐ ＜ ０．０５或Ｐ ＜ ０．０１），当含药血清浓度增加到２０％，ｃｐｍ值出现显著下降，与１０％ ＫＣＣＭ组相比，差别有显著统计学意义（Ｐ ＜ ０．０１）。此外，条件培养液作用４８ ｈ、７２ ｈ后旁分泌组中各浓度组与正常对照的ＮＫＣＣＭ组比较，ｃｐｍ 值的差别有统计学意义（Ｐ ＜ ０．０５或０．０１）。

    ２．４ ＤＨＺＣＷ对经自分泌途径活化ＨＳＣ细胞ＤＮＡ合成的影响

    自分泌组条件培养液对活化的ＨＳＣ作用２４、４８、７２ ｈ后，测定各组的ｃｐｍ值（表４）。可见，对ＨＳＣ分别作用２４、４８、７２ ｈ后，自分泌组中各浓度组之间比较ｃｐｍ值均无明显差别（Ｐ ＞ ０．０５）。

    ３ 讨 论

    ＨＳＣ的激活过程十分复杂，是ＫＣ、肝细胞、窦内皮细胞、ｐｉｔ 细胞、炎症细胞以及ＨＳＣ以旁分泌和／或自分泌形式分泌多种细胞因子协同作用的结果［８］。ＨＳＣ 激活至少包含两个步骤： ① 启动阶段：在肝损伤因子的刺激下，ＨＳＣ的邻近细胞如肝细胞、ＫＣ等被激活，通过旁分泌方式产生大量细胞因子如转化生长因子（ＴＧＦ-β）、血小板衍生生长因子（ＰＤＧＦ）、胰岛素生长因子（ＩＧＦ-１）、肿瘤坏死因子α（ＴＮＦ-α）和炎症因子等［９］，使静止的ＨＳＣ胞体扩大，分裂增殖，表型改变，并产生大量细胞因子，表达α-ＳＭＡ和胶原； ② 持续活化阶段：启动后的ＨＳＣ持续维持活化状态，并不断分裂增殖，产生大量保持活化状态的子代细胞，释放自分泌调节因子如ＴＧＦ-β、ＰＤＧＦ等参与自身活化的调节［１０］。

    活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性ＭＴＴ还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，活化的、代谢旺盛的细胞比静止的、代谢弱的细胞还原作用强，ＭＴＴ比色法正是利用了这一原理被广泛地应用于细胞活性和增殖情况检测。细胞分裂之前，需要复制ＤＮＡ，脱氧胸腺嘧啶核苷（ＴｄＲ）是ＤＮＡ合成所需特有的合成原料，通过测定细胞内掺入的放射性核素（３Ｈ）标记的ＴｄＲ（３Ｈ-ＴｄＲ）量，可反映其ＤＮＡ合成情况，进而较为准确地反映细胞的增殖能力。本组资料的实验结果发现，ＤＨＺＣＷ对经旁分泌途径激活的大鼠ＨＳＣ活化增殖有明显的抑制作用，且作用效应与血清药物浓度存在剂量依赖关系，但对经自分泌途径激活的大鼠ＨＳＣ活化增殖则未见明显抑制作用。由于旁分泌途径是ＨＳＣ活化启动的关键因素，而自分泌活化是ＨＳＣ能够持续增殖的重要原因。我们的观察结果提示， ＤＨＺＣＷ对ＨＳＣ细胞经旁分泌途径活化启动的抑制很可能是该药抗肝纤维化作用的主要途径。

    近年来的研究认为，复方中药抗肝纤维化具有多环节、多层次、多靶点综合作用的优势［１１］，单环节的特异性阻断作用较弱既是其弱点，但也可能是其副作用较少的原因。大黄蛰虫丸是东汉名医张仲景《金匮要略》中的著名方剂，上世纪８０年代以来，国内陆续有用该药治疗慢性肝病肝硬化取得较好临床疗效的报道。我们以往的研究工作发现，ＤＨＺＣＷ不但对体外培养的正常传代ＨＳＣ细胞增殖有直接的抑制作用［４］，而且还能显著促进大鼠ＭＭＰ１基因表达，从而增加对胶原的降解作用［１２］。后者的发现为以往有学者研究发现ＤＨＺＣＷ可显著抑制ＴＩＭＰ生成，并推论ＤＨＺＣＷ可能具有促进ＭＭＰ活化， 从而增加对胶原的降解作用的说法找到了依据［１３］。

    刘成等［１４］研究中药扶正化淤方抗肝纤维化的作用机制表明，扶正化瘀方对ＨＳＣ 旁分泌与自分泌活化途径有明显的抑制作用，其抑制ＨＳＣ自分泌作用的机制可能与ＨＳＣ分泌血管内皮细胞生长因子（ＶＥＧＦ）受抑有关；周正等［１５］的研究也显示，抗纤软肝冲剂能抑制ＨＳＣ的ＴＧＦ-β１ 的基因和蛋白表达，阻断其自分泌放大活化效应。说明中药抗肝纤维化作用的途径和形式很可能具有多样性。因此，虽然本组资料的研究并未发现ＤＨＺＣＷ对经自分泌途径ＨＳＣ细胞的活化增殖有明显抑制作用，但综合以往的多个研究结果，我们仍然有理由相信，ＤＨＺＣＷ的抗肝纤维化作用很可能是通过包括抑制ＨＳＣ细胞经旁分泌途径的活化启动、抑制ＴＩＭＰ的生成和促进ＭＭＰ胶原酶的合成等多途径、多层次、多靶点综合药理作用的结果，值得进一步深入研究。

【参考文献】
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