动脉蒂植入自体游离移植骨再血管化的实验研究

作者：项钊 姚瑶 王娅 华成舸 张富贵 唐休发    作者单位：四川大学华西口腔医院 头颈肿瘤外科，四川 成都 610041 
【摘要】  　　目的 研究动脉蒂植入非血管化自体骨后移植骨血管再生的情况。方法 将36只大白兔双侧桡骨部分截断，剥离骨膜，分别植入双侧咬肌区，其中一侧将远端结扎的颌外动脉蒂植入游离桡骨骨髓腔作为实验侧，另一侧单纯移植作为对照侧。术后3 d、1周、2周、3周、4周、6周处死动物取材，通过组织学检查、血管墨汁灌注、CD34免疫组化染色检测移植骨微血管密度（MVD），观察移植骨的再血管化情况。结果 实验侧术后3 d，对照侧术后2周移植骨出现再血管化。术后3 d、1周、2周、3周、4周，实验侧移植骨的再血管化程度高于对照侧；术后4周，实验侧再血管化程度达到高峰。结论 动脉蒂植入非血管化自体骨的方法具有促进移植骨血管生成的作用。

【关键词】  非血管化自体骨 动脉蒂植入 微血管密度

    An experimental study on angiogenesis of non-vascularized autogenous bone graft with vascular bundle implantation  XIANG Zhao, YAO Yao, WANG Ya, HUA Cheng-ge, ZHANG Fu-gui, TANG Xiu-fa. （Dept. of Head and Neck Oncology, West China College of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, China）

    [Abstract]  Objective  To investigate the effect of vascular bundle implantation in autogenous bone graft on angiogenesis. Methods  Thirty-six New Zealand white rabbits were evaluated in this study. A portion of bilateral radial bones of a rabbit were removed as free bone grafts, whose periostea were peeled off. In test group, the external maxillary artery bundle was passed through the marrow cavity of the bone. In control group, there was no vascular bundle implantation. Each bone was placed in masseter muscle separately. The rabbits were sacrificed and the specimens were procured at 3 days, 1, 2, 3, 4 and 6 weeks after surgery for histological observation, Chinese ink perfusion and CD34 immunohistochemistry. Microvessel density（MVD） was assessed in order to evaluate angio-genesis of autogenous bone grafts. Results  The bone grafts were found revascularization in 3 days after surgery in the test group, whereas at 2 weeks in the control group. In 3 days, 1 week, 2 weeks, 3 weeks and 4 weeks after surgery, the MVD of test group was significantly higher than that of control group. In 4 weeks after surgery, angiogenesis of test group reached to peak. Conclusion  Vascular bundle implantation improved angiogenesis in non-vascularized autogenous bone graft in this study.

    [Key words]  non-vascularized autogenous bone graft； vascular bundle implantation； microvessel density

    对于非血管化自体骨移植，促进其血管生成是骨愈合的关键。本研究利用动物实验观察动脉蒂植入非血管化自体骨后移植骨血管生成的情况，并与单纯骨移植作比较，为该方法的临床应用提供理论依据。

    1  材料和方法

    1.1  实验动物的选择和分组

    选用由四川大学动物实验中心提供的健康成年新西兰大白兔36只，体重为2.3～2.5 kg，雌雄不限。采取自身对照设计，在双侧咬肌区分别植入不带骨膜自体桡骨，一侧在骨髓腔内植入颌外动脉（实验侧），对侧不植入动脉（对照侧），左右侧不限。手术后3 d、1周、2周、3周、4周、6周各处死动物6只，取材。其中3只用于墨汁灌注和常规组织学检测，另3只用于CD34免疫组化染色。

    1.2  手术方法

    将实验动物用0.3 g/L戊巴比妥钠耳静脉麻醉，常规脱毛，将其仰卧于手术台上，四肢固定。常规消毒铺巾，于一侧咬肌前缘皮肤作2.5 cm长纵行切口，暴露并游离一段长2.0 cm颌外动脉，钳夹剪断并结扎远端。无菌条件下行一侧前肢中段外侧纵行切口约2.0 cm，暴露桡骨，环行剥离骨膜显露桡骨，横行切断桡骨中段，长约2.0 cm。将游离的动脉近心端自桡骨骨髓腔穿入，固定并植入邻近咬肌中（桡骨在空气中的暴露时间不超过15 min），庆大霉素生理盐水反复冲洗术野，严密缝合肌层及皮肤。对照侧直接将另一侧游离桡骨植入咬肌区。缝合双侧前肢切口。术后6 d使用青霉素，肌注20万单位，每天2次。手术后8 h给实验动物进食，单独喂养。

    1.3  检测方法

    1.3.1  移植骨的组织学检测  术后3 d、1周、2周、3周、4周、6周各处死3只实验动物，切取移植骨板，标本经10％中性甲醛溶液固定，10％乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）溶液脱钙，按常规组织学方法制成连续石蜡切片，片厚5 μm，苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色。

    1.3.2  移植骨血管墨汁灌注  灌注液选用70％墨汁右旋糖苷（70 mL中华牌墨汁和30 mL低分子右旋糖苷）。采用颈动静脉插管，将肝素生理盐水缓慢注入动脉管，待颈静脉导管内流出清亮液体后即可缓慢注入70％墨汁右旋糖苷，灌注压力不超过16.0 kPa。待兔头面颈部变均匀浓黑后立即解剖取下双侧咬肌区桡骨，10％中性甲醛溶液固定，制成脱钙石蜡切片（5 μm），HE染色，观察再血管化情况。

    微血管密度（microvessel density，MVD）的测定参照Weidner法[1]：对墨汁灌注标本组织切片进行图像采集，切片在40倍光镜下挑选微血管分布最高区域，在200倍视野下计数5个视野的被墨汁染成黑色的血管数目，取其平均值作为MVD，每一个与邻近的微血管明显分离的黑色血管内皮细胞或血管内皮细胞簇都视为独立的微血管。

    1.3.3  移植骨微血管CD34免疫组化染色  术后3 d、1周、2周、3周、4周、6周各处死3只实验动物，切取移植骨板，标本经70％乙醇固定，80％、90％、95％、100％乙醇逐级脱水，甲基丙烯酸甲脂包埋、切片，片厚5 μm。切片经常规烤片、脱塑至水，免疫组化SABC法抗CD34抗体染色，苏木素复染，加拿大树胶封片，光镜下进行观察。

    CD34以血管内皮细胞胞质呈棕褐色为阳性表达，对CD34免疫组化染色切片进行图像采集，切片在40倍光镜下挑选微血管分布最高区域，在200倍视野下计数5个视野的被染成棕褐色的血管数目，取其平均值作为MVD，每一个与邻近的微血管明显分离的染成棕褐色的血管内皮细胞或血管内皮细胞簇都视为独立的微血管。

    1.3.4  组织学切片图像分析  术后3 d、1周、2周、3周、4周、6周各个时间点，实验侧从3个脱钙标本和3个不脱钙标本中分别随机抽取2张组织学切片，共计12张，每一张切片再随机选取5个视野，每个时间点脱钙和不脱钙切片分别为30个观察样本数；对照侧选片同实验侧，每个时间点脱钙和不脱钙切片分别为30个观察样本数。用Nikon DXM1200显微镜对切片进行观察，SPOT Cool CCD摄像头采集图像进入计算机，采用Image-Pro Plus 6.0版本专业图像分析软件对数码图像进行分析。

    1.4  统计学分析

    采用SPSS 12.0统计软件包分析数据，组间比较采用t检验，组内比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），组内两两比较采用LSD-t检验。

    2  结果

    2.1  移植骨HE染色及血管墨汁灌注观察结果

    术后3 d，实验侧移植骨髓腔内出现炎症细胞浸润，成纤维细胞生长，髓腔和骨板见少量墨汁充盈；对照侧移植骨髓腔内出现炎症细胞浸润，成纤维细胞生长，髓腔和骨板未见墨汁充盈。术后1周，实验侧移植骨髓腔内炎症细胞聚集，成纤维细胞增多，骨细胞位于陷窝内，髓腔和骨板见墨汁充盈增多；对照侧移植骨髓腔和骨板仍未见墨汁充盈，部分骨陷窝空虚。术后2周，实验侧移植骨髓腔内炎症细胞聚集，胶原纤维呈不规则、紊乱排列，成骨细胞活跃，髓腔和骨板仍见墨汁充盈较多；对照侧移植骨髓腔和骨板见少量墨汁充盈。术后3周，实验侧移植骨哈佛管扩大，胶原纤维排列有序位于骨小梁周围，骨形成和吸收活跃，髓腔和骨板仍见墨汁充盈；对照侧移植骨髓腔和骨板仍见少量墨汁充盈，哈佛管扩大。术后4周，实验侧移植骨哈佛管进一步扩大，胶原纤维明显增多，骨小梁形成，髓腔和骨板见大量墨汁充盈，哈佛管内可见多根血管充盈墨汁，骨吸收陷窝内血管充盈墨汁（图1）；对照侧移植骨髓腔和骨板见墨汁充盈增多，哈佛管内可见血管充盈墨汁，骨吸收陷窝内见血管充盈墨汁（图2）。术后6周，两侧移植骨髓腔内炎症细胞减少，胶原纤维充满髓腔，排列有序，骨改建中，髓腔和骨板见墨汁充盈，但数量减少。

    2.2  移植骨微血管CD34免疫组化染色结果

    术后3 d，实验侧移植骨髓腔和骨板见少量棕褐色阳性表达；对照侧移植骨髓腔和骨板见极少量棕褐色阳性表达。术后1周，实验侧移植骨髓腔和骨板见棕褐色阳性表达增多；对照侧移植骨髓腔和骨板仍只见极少量棕褐色阳性表达。术后2周，实验侧移植骨髓腔和骨板仍见棕褐色阳性表达较多；对照侧移植骨髓腔和骨板见少量棕褐色阳性表达。术后3周，实验侧移植骨髓腔和骨板仍见棕褐色阳性表达，哈佛管扩大；对照侧移植骨髓腔和骨板仍见少量棕褐色阳性表达。术后4周，实验侧移植骨髓腔和骨板见大量棕褐色阳性表达，哈佛管进一步扩大，哈佛管内多处出现棕褐色阳性表达，骨吸收陷窝内见棕褐色阳性表达（图3）；对照侧移植骨髓腔和骨板见棕褐色阳性表达增多，哈佛管及骨吸收陷窝内可见棕褐色阳性表达（图4）。术后6周，两侧移植骨髓腔和骨板见棕褐色阳性表达，但数量减少。

    2.3  移植骨组织学切片图像分析结果

    移植骨墨汁灌注MVD检测结果见表1。移植骨CD34免疫组化染色MVD检测结果见表2。由表1、2可见，实验侧与对照侧比较，术后3 d、1周、2周、3周、4周实验侧移植骨MVD大于对照侧（P<0.05）；术后6周，两侧MVD间差异无统计学意义（P>0.05）。实验侧术后3 d、对照侧术后2周移植骨出现再血管化；术后3 d、1周、2周、3周、4周，实验侧移植骨的再血管化程度高于对照侧；术后4周，实验侧的再血管化程度达到高峰。

    3  讨论

    非血管化骨移植术后的骨吸收是一个很难避免的问题，尽可能延缓或减少骨吸收，促进骨生长是成功骨移植所需的基本条件。骨形成和局部区域的血管生成联系紧密。本研究选择动脉蒂植入非血管化自体骨基于动脉生成。动脉生成是指由于动脉阻塞或狭窄，血流再分配使侧支微动脉血流量增加、血管内剪切力增加，引起细胞增殖、血管重塑，从而形成大的有功能的侧支传导动脉[2-3]。这是动脉蒂优于静脉蒂的原因。Kosaki等[4]认为动脉阻塞后，血流再分配，使侧支微动脉（管径30～50 μm）血流量增加，血管内剪切力增大，从而激活内皮细胞（endo-theliocyte，EC）。活化的EC合成和分泌单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）、转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、粒-单核细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）、单核细胞间黏附分子-1（monocyte adhesion molecule-1，ICAM-1）和血管细胞黏附分子-1（vascular celladhesion molecule-1，VCAM-1）作用于单核细胞来促进动脉生成。Abo-Auda等[5]认为在创伤愈合过程中，血管生成是一个包括细胞、生长因子、细胞外基质、生物力学刺激等多因素相互作用的复杂过程。新生成的血管网可以改善组织细胞的氧和营养物质的供给并清除细胞碎片，这对组织修复非常重要。同样局部血管分布也影响骨组织的分化。移植部位的低氧张力和高代谢活性促进了血管生成[6]。在此过程中，周围血管为骨修复提供血供，血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial cell growth factor，VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、TGF-β和骨形态发生蛋白（bone morphogene-tic protein，BMP）等参与了对血管生成和骨再生的双重调节，使骨修复能够顺利完成。本实验结果显示，两种反映微血管生成情况的方法结果一致。在研究中可以观察到将兔颌外动脉蒂植入游离自体桡骨后的再血管化过程：在术后3 d，实验侧出现再血管化，而对照侧术后2周移植骨出现再血管化。术后3 d、1周、2周、3周、4周实验侧均比对照侧有利于移植骨的血管生成。

    MVD的最大值出现在各组术后4周。实验侧术后4周再血管化程度达到高峰；术后6周再血管化程度有所下降，处于相对平缓阶段。对照侧移植骨的再血管化在术后2、3、4、6周发生，术后3周再血管化程度有所下降，其余时间段血管生成程度相当。以上结果说明动脉蒂的植入可以早期促进移植骨的血管生成。

    本研究是将单纯动脉蒂植入非血管化自体骨来探讨移植骨血管生成情况的动物实验。以往有人进行带血管蒂骨瓣移植，但血管蒂能到达的区域有限，其适应证范围小。非血管化自体骨联合受区的动脉蒂植入则是相对简单易行的方法。实验研究证明了动脉蒂植入非血管化自体骨的血管再生的范围和程度，为进一步探讨移植骨的愈合机制提供了实验基础。

【参考文献】
  [1] Weidner N, Semple JP, Welch WR, et al. Tumor angiogenesis and metastasis-correlation in invasive breast carcinoma[J]. N Engl J Med, 1991, 324（1）：1-8.

[2] Hershey JC, Baskin EP, Glass JD, et al. Revascularization in the rabbit hindlimb： Dissociation between capillary sprouting and arteriogenesis[J]. Cardiovasc Res, 2001, 49（3）：618-625.

[3] Helisch A, Schaper W. Arteriogenesis： The development and growth of collateral arteries[J]. Microcirculation, 2003, 10（1）：83- 97.

[4] Kosaki K, Ando J, Korenaga R, et al. Fluid shear stress increa- ses the production of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor by endothelial cells via mRNA stabilization[J]. Circ Res, 1998, 82（7）：794-802.

[5] Abo-Auda W, Benza RL. Therapeutic angiogenesis： Review of current concepts and future directions[J]. J Heart Lung Tran- splant, 2003, 22（4）：370-382.

[6] Carter DR, Loboa Polefka EG, Beaupré GS. Mechanical in- fluences on skeletal regeneration and bone resorption[M]//Davies JE. Bone engineering. Toronto： Em Squared Incorporated, 2000： 358-368.