鼻息肉及下鼻甲黏膜成纤维细胞中组胺受体的表达

　作者：崔哲洙,许英姬,周海辉,崔春莲,金顺吉    作者单位：延边大学附属医院 耳鼻咽喉科，吉林 延吉 133000

　【摘要】  ［目的］了解鼻息肉成纤维细胞中组胺受体及其亚型的存在与否，比较鼻息肉与下鼻甲黏膜成纤维细胞中组胺受体的表达程度.［方法］选择5例鼻息肉组织，以同侧下鼻甲黏膜为对照.经鼻内窥镜手术切除鼻息肉及部分下鼻甲黏膜,培养成纤维细胞.采用RTPCR方法观察鼻息肉成纤维细胞中的组胺受体及其亚型，用实时PCR方法分别比较鼻息肉与下鼻甲黏膜成纤维细胞中组胺受体mRNA的表达情况；用流式细胞仪测定鼻息肉及下鼻甲黏膜成纤维细胞中组胺受体蛋白的表达.［结果］鼻息肉成纤维细胞中可见1型及2型组胺受体存在，其表达程度低于下鼻甲黏膜成纤维细胞，鼻息肉中仅可见少量的组胺受体蛋白表达.［结论］鼻息肉成纤维细胞中只有少量的1型及2型组胺受体的表达.

　【关键词】  鼻息肉;受体,组胺;纤维母细胞

　Expression of histamine receptor in fibroblast of nasal polyp and nasal turbinate mucosa

    CUI Zhezhu, XU Yingji, ZHOU Haihui, CUI Chunlian, JIN Shunji*

    (Department of Otorhinolaryngoloyg, Affiliated Hospital of Yanbian University, Yanji 133000, Jilin, China)

    ABSTRACT:OBJECTIVETo investigate whether the histamine receptors and its subtypes were in the fibroblast of nasal polyp, and then to compare the degree of expression in fibroblasts between nasal polyp and inferior turbinate mucosa.METHODS Each of five tissues of nasal polyp and nasal inferior turbinate mucosa as controls were taken from inferior turbinate during nasal surgery, and the fibroblasts were cultured from each mucosa. The subtypes of histamine receptor in the fibroblasts were identified by RTPCR, the expression level of histamine receptors mRNA were by real time PCR, respectively, and the protein expression of histamine receptors were evaluated in nonstimulated condition by flow cytometry.RESULTSHistamine receptor 1 and 2 were identified in the fibroblasts of nasal polyp, and its expression level was lower in the fibroblasts of nasal polyp than that of inferior turbinate mucosa, and a little of histamine receptors protein was expressed in nasal polyp.CONCLUSIONSThere is a little of expression of histamine receptor 1 and 2 in the fibroblasts of nasal polyp.

    Key words:nasal polyps;receptors, histamine;fibroblast

    组胺不仅在细胞及组织内发挥各种生理作用，而且可引起变应性鼻炎.组胺的各种作用是通过与细胞表面的组胺受体结合实现的，到目前为止所了解的组胺受体共有4种，分别为1,2,3,4型［12］.不同亚型的组胺受体起着不同的G联结蛋白质受体的功能,其中人1型组胺受体基因位于3p25染色体上，在胎盘中可见较多的表达，在肺、骨骼肌、心脏及脑组织中可见少量的表达［34］.2型组胺受体基因位于13号染色体上，在胃中有较强的表达，亦表达于脑组织及心脏［5］.胃壁细胞2型组胺受体被刺激时，可促进胃酸的分泌.3型组胺受体位于20号染色体上，可在丘脑的各个部位内选择性地表达［6］，并表达于中枢神经系统及末梢神经系统，对神经起调节作用［7］.4型组胺受体基因位于18q11染色体上，多表达于骨髓及脾脏，亦表达于末梢血液、胸腺、小肠及结肠［89］.目前认为4型组胺受体可能是Gi结合型受体，对免疫功能的影响及作用机制尚不十分清楚.成纤维细胞在人体中维持组织的结构，分泌各种化学趋化因子如IL8，CMCSF，eotaxin，IL1,IL6等［1014］.上述现象提示，鼻息肉组织成纤维细胞中可能存在组胺受体，而其在鼻息肉的生成及发育过程中可能起着重要的作用.本研究旨在探讨鼻息肉组织成纤维细胞中组胺受体及其亚型的存在与否，观察鼻息肉组织中组胺受体蛋白的表达程度.

    1  对象及方法

    1.1  对象  选择鼻息肉患者5例为研究对象，并将同侧的下鼻甲黏膜为对照组.所有患者均有鼻涕及鼻塞等鼻部症状，MAST检查呈阴性，AST及NPT检查亦呈阴性，排除合并变应性鼻炎；所有患者均无吸烟史及其他疾病.术前2周内禁用激素、抗生素及抗组胺类药物.

    1.2  方法

    1.2.1  细胞培养  行功能性鼻内窥镜手术，切除鼻息肉及部分下鼻甲黏膜，行组织细胞培养.成纤维细胞培养：用含有500U/mL青霉素,500mg/L链霉素,6mg/L fungizon(GIBCO,美国)的PBS洗涤3次，将下鼻甲黏膜切成1mm3大小，置于培养皿内，室温下放置5min，使之黏附，再添加含有100g/L FBS的Dulbeco’s Modified Eagle’s medium(DMEM, GIBCO,美国)培养液进行培养，当形成单层成纤维细胞后除去培养液，用PBS洗涤，添加0.5g/L胰蛋白酶EDTA，置于37℃，50mL/L二氧化碳培养箱内处理5min，使细胞分离，用含有20g/L FBS及抗生素的DMEM培养液浮游细胞，进行隔代培养（图1）.将培养的成纤维细胞分别灌注到6孔培养皿中，每孔细胞数为3×105个，本实验中应用的是2代培养的纤维母细胞.

    图1  培养完成后的鼻黏膜成纤维细胞

    1.2.2  RTPCR  RNA的分离依照RNABee溶液的分离方法(Teltest,Inc,Friendswood,美国)进行.在直径为60mm培养皿里放入1mmol/L RNABee溶液进行溶解，添加0.2倍的氯仿使之混合后置于冰块上，5min后用离心机（Centrifuge 5402,Eppendrof,德国）于12000r/min，4℃离心15min，取上清液，加入同等量的isopropanol，在室温条件下沉淀10min，随后以12000r/min，4℃离心5min，弃去上清液，向沉淀物中加入750mL/L乙醇0.8mL，以7500r/min，4℃离心5min，置于空气内10min，使沉淀物在空气中干燥后分离出ＲＮＡ，将其用ＤＥＰＣ处理过的蒸馏水溶解.采用荧光分光光度计(Ultraspec 2000,Parmacia Biotech,Cambridge,英国)于波长为260nm及280nm处测定ＲＮＡ值，Ａ２６０／Ａ２８０比值为１.５～１.８，将ＲＮＡ置于-70℃保存.为进行酵素聚合连锁反应需合成相补的ＤＮＡ（cDNA）.将１μg ＲＮＡ调节到用ＤＥＰＣ处理过的蒸馏水１０μL中，７０℃加热５min，于冰块上放置5min.加入２μL的１０×缓冲剂(0.1mol/L Tris盐酸, pH值为9.0,0.5mol/L氯化钾,10g/L Trition X100),取4μL 25mmol/L氯化镁， 2μL 10mmol/L dNTP,0.5μL(40U/μL)RNase抑制物,加入15U ＡＭＶ　反向transcriptase(Promega,Medison,WI,美国)后将总剂量调整至２０μL.反应条件为４２℃ １h，　９５℃ ５min，　４℃ ５min.PCR反应如下:在２μL cDAN中加入５μL的１０×ＰＣＲ buffer(100mmol/L Tris盐酸, pH值为8.3, 0.5mol/L氯化钾,15mmol/L氯化镁),4μL的2.5mmol/L dNTP,20pmol上游及下游引物，２U Ｔaq DNA聚合酶(TAKARA,日本)，灭菌蒸馏水调整至50μL.利用遗传因子增幅器（Biometra, Gottingen,德国）进行扩增，具体的条件为组胺受体（HR1，HR2，HR3，HR4与βactin）初期变性95℃ 5min，95℃ 1min,55℃ 1min，72℃延长1min，共30个周期（βactin是25周期），最后的延长是72℃10min.10μL PCR生成物内混合加入2μL的6×载入缓冲液(2.5g/L溴酚蓝,2.5g/L二甲苯蓝,300g/L蔗糖)，再添加0.5mg/L溴化乙锭，于含0.5×TBE(45mmol/L Trisborate, 1mmol/L EDTA)的20g/L琼脂糖凝胶中，以90V电压下电泳1h，利用Gel Doc 1000凝胶成象系统（BioRad, Hercules,CA,美国)观察条带.1型及2型组胺受体的阳性对照选择鼻黏膜的上皮细胞，3型及4型的选择人末梢血液白细胞.Realtime PCR：向1.5mL实验管内加入25mmol/L氯化镁2.4μL,2μL含Lightcycler fast start enzyme的DNA master SYBR green Ⅰ, 10pmol上游及下游引物，以蒸馏水调节为１８μL，向１８μL混合物中加入２μL cDNA后，分别灌注到离心管内，于７００r/min条件下离心５min，移至Lightcycler增幅器（Roche Applied Science, Mannheim,美国）.１型及２型组胺受体βactin的退火温度为５５℃，根据ＰＣＲ生成物的大小将速度调节为２５bp/s进行实时扩增.

    1.2.3  流式细胞仪检测  用ＰＢＳ将已形成单层的成纤维细胞洗涤2次，37℃条件下用0.5g/L胰蛋白酶EDTA处理5min，向细胞内添加100g/L  FBS，收集细胞，以12000r/min，４℃离心５min，用冷PBS洗涤细胞沉淀物２次，添加１型及２型组胺受体的1次抗体（Chemicon,Temecula,CA,美国）稀释２０倍，在４℃条件下反应１h，待反应结束后用冷PBS洗涤２次，用异硫氰酸荧光素结合抗体(Chemicon, Temecula,CA,美国)稀释5000倍后，于４℃条件下反应1h，用冷PBS洗涤２次，利用ＦＡＣＳ进行测定.在无刺激条件下培养２４h，测定１型及２型组胺受体蛋白.

    1.2.4  统计学处理  观察同一患者鼻息肉组织及下鼻甲黏膜成纤维细胞中各型组胺受体的表达，用实时扩增了解１型及２型组胺受体表达程度.将目的基因交点与βactin基因交点比值作为受体的表达程度并以均数±标准偏差（±SD）来表示.用ＳＰＳＳ１２.０统计软件对数据进行统计学处理，进行MannWhiteny’s U检验.

    2  结果

    RTPCR结果表明，可见１型及２型组胺受体mRNA表达，未见３型及４型组胺受体表达（图2）.实时扩增结果见，鼻息肉组织成纤维细胞内1型及2型组胺受体mRNA的表达较下鼻甲鼻黏膜成纤维细胞低，但相比较均无统计学意义（P=0.19，P=0.14,图3）.流式细胞分析实验结果示，无刺激时1型组胺受体蛋白的表达量在鼻息肉组织及下鼻甲黏膜组织中均极低，无显著性差异（图4）,2型组胺受体蛋白的表达在下鼻甲黏膜组织较多（图5）.

　　3  讨论

    组胺生成于嗜中性粒细胞及肥大细胞，参与各种过敏反应.气道上皮微环境中的肥大细胞可合成组胺，增加气道的渗透性［15］.Jordana等［16］认为，组胺可使体外培养的成纤维细胞增殖，其作用是通过2型组胺受体完成的；thymikine可使体外培养的人皮肤成纤维细胞增殖，而组胺可通过1型组胺受体促进蛋白激酶C及佛波酯酵素活性，抑制thymikine对成纤维细胞的增殖作用［17］.目前，对在鼻息肉的形成过程中成纤维细胞及成纤维细胞中的组胺受体所起的作用虽然尚未完全阐明，但可以肯定的是鼻息肉的形成仅与１型及２型组胺受体有关，而与３型及４型组胺受体则无关.本研究结果亦表明，鼻息肉成纤维细胞中只可见1型及2型组胺受体的表达，而未见3型及4型的表达.目前虽然对鼻息肉的形成过程尚无统一的认识，但与变应性鼻炎有关系的假设已被受重视.Okayama等［18］认为，人鼻黏膜组织中分布的1型组胺受体主要分布于小动脉、静脉及海棉静脉窦等血管内皮细胞内，而血管平滑肌及鼻黏膜下腺体等组织中则未见分布.Boucher等［19］报道，鼻黏膜切片组织中存在2型组胺受体的表达，且在变应性鼻炎鼻黏膜组织中的表达强度明显高于非变应性鼻炎，且原位杂交分析亦支持上述结果.本研究采用流式细胞分析方法观察了组胺受体蛋白的表达，发现其表达量较少，但组胺受体蛋白可以细胞内及外的形态表达，而流式细胞分析方法却不能准确地测定细胞内的蛋白量.蛋白表达较少的原因考虑可能与如下几点相关；1）可以肯定鼻息肉与下鼻甲黏膜成纤维细胞中有大量的组胺受体mRNA表达；2）组胺受体蛋白合成后受到某些其他代谢产物的影响，迅速溶解；3）大部分组胺受体蛋白仅在细胞内停留，而未到达细胞膜表面；4）可能在某些因素的影响下蛋白质翻译受阻碍；5）需要特定的条件，如各种细胞因子刺激或特殊酶参与等.

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