腹外侧眶皮层内吗啡诱发的抗伤害效应的机制

　　作者：屈超玲，贾红，霍福权    作者单位：西安交通大学医学院生理学与病理生理学系,教育部环境与基因相关疾病重点实验室，陕西 西安 710061

　　【摘要目的: 明确腹外侧眶皮层(VLO)内微量注射吗啡产生抗伤害效应的机制是否通过GABA能调制介导的. 方法: 以辐射热诱发的大鼠甩尾反射潜伏期的变化作为伤害性反应的指标. 结果: VLO内微量注射选择性GABAA受体拮抗剂荷包牡丹碱(100, 200, 500 ng)可剂量依赖性抑制辐射热诱发的大鼠尾反射潜伏期. VLO内微量注射吗啡(5.0 μg) 10 min后，同一部位注射荷包牡丹碱(100 ng)可增加吗啡诱发的抗伤害效应, 而VLO内微量注射吗啡(5.0 μg) 10 min后，同一部位注射GABAA受体激动剂muscimol (250 ng)可减弱吗啡诱发的抗伤害效应. 结论: VLO内GABAA受体参与吗啡诱发的抗伤害效应，吗啡可能直接抑制了GABA能中间神经元，使VLO至PAG的投射神经元去抑制，间接激活了脑干下行抑制，在脊髓水平抑制了伤害性信息的输入而实现的.

　　【关键词】  吗啡； 受体,GABAA； 腹外侧眶皮层； 抗伤害效应； 大鼠

　　Mechanisms of morphineinduced antinociception in the ventrolateral orbital cortex of the rat

    QU ChaoLing, JIA Hong, HUO FuQuan

    Department of Physiology and Pathophysiology, Key Laboratory of Environment and Genes Related Diseases, Ministry of Education, School of Medicine, Xian Jiaotong University, Xian 710061, China

    【Abstract】 AIM: To examine whether γaminobutyric acid (GABA) modulation is involved in morphineinduced antinociception in the ventrolateral orbital cortex (VLO) of the rat. METHODS: Noxious heatevoked tail flick latencies were measured in the lightly anesthetized rats. RESULTS: Microinjection of bicuculline (100, 200, 500 ng), a selective GABAA receptor antagonist, into VLO depressed the radiant heatinduced tail flick reflex in a dosedependent fashion. 100 ng bicuculline microinjected into the VLO sites where morphine (5.0 μg) had been microinjected 10 min earlier enhanced the morphineevoked inhibition of the tail flick reflex, however, muscimol (250 ng), a GABAA receptor agonist, microinjected into the VLO sites where morphine (5.0 μg) had been microinjected 10 min earlier attenuated the morphineevoked inhibition of tail flick reflex. CONCLUSION: The GABAA receptors are involved in the modulation of VLO morphineinduced antinociception, which supports the hypothesis that morphine may directly inhibit the GABAergic inhibitory interneurons leading to indirect activation of the descending antinociceptive pathway through a disinhibitory effect on the VLO output neurons and depression of the nociceptive inputs at the spinal cord level.

    【Keywords】 morphine; receptor, GABAA; ventrolateral orbital cortex; antinociception; rat

　　0引言

    以往的研究证实前额叶的腹外侧眶皮层（ventrolateral orbital cortex, VLO）通过丘脑中央下核(Sm)接受来自脊髓和延髓背角Ⅰ层的纤维投射，并且VLO内有纤维投射到双侧导水管周围灰质（PAG）的腹外侧部［1］. 研究提示中枢神经系统存在一个由脊髓SmVLOPAG脊髓构成的内源性抗伤害环路. 进一步的研究发现VLO内微量注射吗啡可抑制甩尾反射和甲醛诱发的伤害性行为，非选择性阿片受体拮抗剂纳络酮可翻转这些效应［2-4］，提示VLO通过激活VLOPAG通路，参与阿片受体介导的抗伤害效应. 吗啡对神经元的直接作用是产生抑制效应，那么VLO内微量注射吗啡是如何兴奋VLO到PAG的神经元，进而激活脑干下行抑制系统而产生抗伤害效应的呢？我们推测吗啡对下行投射神经元的兴奋作用可能是通过抑制了一个抑制性中间神经元而产生的［5］. 研究报道VLO内有GABA免疫阳性神经元和GABAA/B受体分布［6-7］. 因此，吗啡微量注射到VLO产生的镇痛作用很可能是通过抑制了GAGB能中间神经元，间接激活了VLO内投射到PAG的神经元的活动，进而激活PAG脑干下行抑制系统，在脊髓水平抑制伤害性信息的传递而实现的. 因此，本研究的目的是观察VLO吗啡产生抗伤害效应的机制是否由GABA能调制介导实现.

    1材料和方法

    1.1材料成年健康雄性SD大鼠33只，体质量270~300 g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供. 盐酸吗啡（沈阳）、荷包牡丹碱（RBI/Sigma）、muscimol（RBI/Sigma）. 所有药物均用生理盐水新鲜配制.

    1.2方法

    1.2.1动物手术大鼠用戊巴比妥钠（50 mg/kg，ip）麻醉后，常规行气管插管和颈静脉插管术. 将动物头部固定在脑立体定位仪上,调整门齿板使前、后囟在同一水平面上. 在VLO上方钻孔开颅，将一引导管（外径0.8 mm）插入脑内，使其尖端位于VLO上方2 mm处. 然后将动物尾巴后1/3涂黑. 在实验过程中，通过持续静脉灌注戊巴比妥钠（速度为4~5 mg/kg·h）使动物维持在稳定的浅麻状态. 在此状态下，动物没有自发活动，但可诱发出甩尾反射. 在实验过程中，通过一电热毯使动物的肛温保持在37~38℃，防止因麻醉和药物注射引起体温的变化.

    1.2.2甩尾反射实验用一灯泡（250 W，24 V）的辐射热透过一3 mm×4 mm小孔作为伤害性热刺激，将其施加于涂黑的动物尾部后1/3以诱发甩尾反射(TF). 从加热开始至动物将其尾巴离开热源的时间为甩尾反射潜伏期(TFL)，以此为指标观察VLO内微量注射药物对甩尾反射的效应. 在实验开始前，调整热刺激强度使TFL维持在3.0~3.5 s之间，每间隔5 min测量1次，共计65 min. 在脑内微量注射之前至少连续测量3次，取其平均值作为基础对照. 在脑内注射之后，如甩尾反射潜伏期超过7 s动物仍未发生甩尾反射则停止给予热刺激，以防止皮肤损伤，并将其TFL记为7 s.

    1.2.3脑内注射实验中所用试剂均于实验前溶解于生理盐水中. 脑内微量注射容积均为0.5 μL. 为了确定VLO内注射吗啡对甩尾反射的效应，将一1.0 μL的微量注射器经引导管插入脑内. 该微量注射器的尖端突出引导管尖端2 mm，即到达VLO位置. 根据图谱［8］，VLO的定位为：前囟前2.2~4.2  mm，旁开1.8~2.2 mm，脑表面下3.8~5.1 mm. 在连续测量三次TFL稳定后，以恒定的速度缓慢注入吗啡(1 g/L)，3 min内注完. 注射完毕后马上测量动物的TFL，并以每5 min的间隔连续测量65 min. 为了确定选择性GABAA受体在VLO伤害性感受调制中的作用，观察不同剂量的GABAA受体拮抗剂荷包牡丹碱（Bic，100, 200, 500 ng）注射到VLO后对甩尾反射的效应. 对照组用等容量的生理盐水代替. 为了观察GABAA受体拮抗剂或激动剂在吗啡抑制甩尾反射效应中的作用，在吗啡注射到VLO后15 min后同一位点注射GABAA受体拮抗剂荷包牡丹碱100 ng或激动剂muscimol ( 250 ng)，继续观察动物TFL的变化. 在同一只动物身上进行第二次实验前，至少间隔1.5 h，以排除上次注射药物的效应和保证其潜伏期恢复到基础值.

    1.2.4组织学再建实验结束时，同一位点注射等量的膀胺天蓝以标记药物作用部位. 在深度麻醉状态下，将动物依次用生理盐水和40 g/L甲醛经心脏灌注. 灌毕取出脑组织并将其在40 g/L甲醛溶液中后固定3~7 d，尔后置入300  g/L蔗糖溶液中至沉底(4℃). 冰冻切片机切片，片厚30 μm，裱片、干燥、克紫染色. 最后将切片投影放大，确定注射点的位置，按组织学图谱进行组织学再建.

    统计学处理: 用双因素重复测量方差分析（Twoway RM ANOVA）以及Post hoc比较中的Bonferroni ttest进行统计学分析. 实验结果用x±s表示. 分析的内容包括不同组之间在给药后的整体差异，以及各个时间点上的差异. P<0.05表示有统计学意义.

    2结果

    2.1VLO內注射荷苞牡丹碱对甩尾反射的效应VLO内微量注射不同剂量的GABAA受体拮抗剂荷包牡丹碱(100, 200, 500 ng),可剂量依赖性地抑制辐射热诱发的TF反射(r=0.947, P=0.027). 在65 min观察期间荷包牡丹碱注射后TFL分别增加至［(3.9±0.1) s (n=9, 100 ng), (4.6±0.1) s (n=10, 200 ng)和(5.4±0.2) s (n=8, 500 ng)］(图1)，各处理组之间(P<0.001),时间过程之间(P<0.001)和处理×时间过程之间(P=0.006)都有统计学意义. Post hoc Bonferroni ttest分析表明，VLO内微量注射500 ng甩尾反射的抑制效应大于200,100 ng荷包牡丹碱和生理盐水(t=5.08, P<0.001; t=9.51, P<0.001; t=12.8, P<0.001)，注射200 ng对甩尾反射的抑制效应显著大于100 ng荷包牡丹碱和生理盐水（t=4.82, P<0.001; t=8.21, P<0.001）. 注射100 ng对甩尾反射的抑制效应大于生理盐水（t=3.17, P=0.02）. 各时间点上有差异(图1A,B).

    2.2VLO內注射GABAA受体拮抗剂对吗啡抑制甩尾反射的效应的影响在吗啡(5.0 μg)微量注射（时间记为0 min）到VLO后15 min，对甩尾反射的抑制效应很明显(图2A,B). 此时同一部位微量注射荷包牡丹碱(100 ng)可明显加强吗啡诱发的抑制效应(图2A). 生理盐水组、单纯吗啡组和吗啡＋荷包牡丹碱组在各处理因素之间(P<0.001)和时间过程(P=0.01)均有统计学差异，但处理因素×时间过程之间无交互作用(P=0.21). 在吗啡注射开始15 min后的观察期内，单纯吗啡组TFL为（4.8±0.26） s，小于吗啡＋荷包牡丹碱组［(6.1±0.27) s, n=9； t=4.38, P<0.001］，大于盐水对照组［(3.5±0.04) s, n=9; t=4.31, P<0.001］.

    aP<0.05, bP<0.01 vs 100 ng; cP<0.05, eP<0.05 vs生理盐水; dP<0.001  vs 200 ng. A: 各组之间65 min观察期各时间点比较; B: 荷包牡丹碱在VLO内的注射位点. AI: 无颗粒岛叶皮层；AOP: 前嗅核；Bic: 荷包牡丹碱；Cg: 扣带皮层； Fr:  前脑；IL: 缘下回； LO: 外侧眶皮层；Pir: 梨状皮层；VLO: 腹外侧眶皮层.

    图1不同剂量的GABAA受体拮抗剂荷包牡丹碱微量注射到VLO后对TF影响的时间经过曲线

    aP<0.05, bP<0.01 vs单纯吗啡； cP<0.05, dP<0.001 vs生理盐水. A: 各组之间65 min各时间点上的比较; B: VLO内吗啡+荷包牡丹碱组的注射位点.

    图2VLO内微量注射荷包牡丹碱(100 ng)对吗啡抑制甩尾反射效应的影响

    2.3VLO內注射GABAA受体激动剂对吗啡抑制甩尾反射的效应的影响吗啡(5.0  μg)微量注射（时间记为0 min）到VLO后15 min，甩尾反射已被明显抑制，进一步微量注射GABAA受体激动剂荷包牡丹碱 (250 ng)到同一部位可减弱吗啡诱发的抑制效应(图3A,B). 生理盐水组、单纯吗啡组和吗啡＋荷包牡丹碱组在各处理因素之间(P<0.001)，时间过程(P<0.001)，处理因素×时间(P=0.007)均有统计学意义. 吗啡＋荷包牡丹碱组的TFL平均值为(3.7±0.10) s，和吗啡注射组TFL (4.8±0.26) s相比有统计性差异（t=4.81, P<0.001, n=9），但和生理盐水照组TFL［(3.5±0.04) s, n=9)］相比没有显著性差异(t=0.79, P>0.05).

    aP<0.05, bP<0.01 vs单纯吗啡. A: 各组之间65 min的整体效应; B: VLO内吗啡+荷包牡丹碱的注射位点.

    图3VLO内微量注射muscimol (250 ng)对吗啡抑制甩尾反射效应的影响

    3讨论

    形态学研究表明VLO内有相当数量的GABA能免疫反应阳性神经元［6］，以及GABAA/B的受体表达［7］. 我们实验室的研究结果表明GABA样免疫阳性标记的神经元的胞体分布在整个VLO的各层，其中Ⅱ和Ⅵ层较多［9］. GABA能神经元及其受体可能参与调制VLO介导的抗伤害感受效应. 本研究结果表明VLO内微量注射GABAA受体拮抗剂荷包牡丹碱剂量依赖性抑制大鼠甩尾反射，提示GABAA受体对VLO到PAG的投射神经元存在紧张性抑制作用，阻断这一抑制作用可加强VLOPAG脑干下行抑制系统的活动，在脊髓水平抑制伤害性输入. 因此，如果给予拮抗剂直接阻断GABAA受体，抑制GABA末梢释放GABA神经递质都产生脱抑制效应，并且在痛觉调制系统产生抗伤害效应.

    以往的研究证实VLO内微量注射吗啡或μ阿片受体激动剂endomorphin1可剂量依赖性抑制大鼠甩尾反射、甲醛激发的伤害性行为和脊髓背角神经元cfos蛋白的表达，并且这些抑制性效应可被非选择性阿片受体拮抗剂纳络酮或者选择性μ阿片受体拮抗剂βFNA (βfunaltrexamine hydrochloride)所拮抗［2-4］. 这些研究结果提示VLO参与μ阿片受体介导的抗伤害效应. VLO内微量注射吗啡或μ阿片受体激动剂endomorphin1产生的抗伤害性效应可能是由于激活了VLOPAG脑干下行抑制系统，在脊髓水平抑制伤害性输入而实现的. 阿片肽对神经元的直接作用是增加K+的电导，使细胞膜发生超极化［5］，那么吗啡对神经元的兴奋作用是如何实现的呢？免疫组织化学实验证实VLO内广泛分布着GABA能中间神经元和μ阿片受体［6,10］. 霍福权等［9］的研究发现VLO内大约90％ GABA能神经元及其末梢表达μ阿片受体. 因此，VLO内微量注射吗啡对下行痛觉调制系统的激活可能是由于吗啡抑制GABA能中间神经元，取消了它对投射神经元的紧张性抑制而实现的. 本研究证实VLO内吗啡的作用机制和抑制性GABA能中间神经元有密切的关系. 局部给予阿片或刺激诱发的内源性阿片肽的释放直接抑制了GABA能中间神经元对VLOPAG投射神经元的抑制作用（去抑制），从而激活VLOPAG脑干下行抑制系统，在脊髓水平抑制伤害信息的输入而实现的.

【参考文献】
  ［1］ 唐敬师，袁斌. 一个新的痛觉调制通路的发现［J］. 西安交通大学学报(医学版), 2002，23(4): 329-332.

［2］ Huang X, Tang JS, Yuan B, et al. Morphine applied to the ventrolateral orbital cortex produces a naloxonereversible antinociception in the rat ［J］. Neurosci Lett, 2001,299(3): 189-192.

［3］ 黄新，唐敬师，袁斌，等. 腹外侧眶皮层内给予吗啡对福尔马林实验诱发脊髓背角cFos表达的抑制效应［J］. 西安医科大学学报，2002，23(2)：104-107.

［4］ Xie YF, Wang J, Huo FQ, et al. MU but not δ and κ opioid receptor involvement in the ventrolateral orbital cortex opioidevoked antinociception in formalin test rats［J］. Neuroscience, 2004,126(3):717-726.

［5］ Heinricher MM, Morgan MM, Fields HL. Direct and indirect action of morphine on medullary neurons that modulate nociception［J］. Neuroscience,1992,48(2) :533-543.

［6］ Esclapez M, Campistron G, Trottier S. Immunocytochemical localization and morphology of GABAcontaining neurons in the prefrontal and frontoparietal cortex of the rat ［J］. Neurosci Lett, 1987,77(2): 131-136.

［7］ Princivalle AP, Pangalos MN, Bowery NG, et al. Distribution of GABA (B (1a)), GABA (B (1b)) and GABA (B2) receptor protein in cerebral cortex and thalamus of adult rats［J］. Neuroreport, 2001,12(4):591-595.

［8］ Paxinos G, Watson C. The rat brain in stereotaxic coordinates［M］. 2th ed. Sydney: Academic Press, 1986:10-15.

［9］ Huo FQ, Wang J, Tang JS, et al. GABAergic neurons express mopioid receptors in the ventrolateral orbital cortex of the rat［J］. Neurosci Lett, 2005,82(3):265-268.

［10］ Heinricher MM, Tortorici V. Interference with GABA transmission in the rostral ventromedial medulla: Disinhibition of offcells as a central mechanism in nociceptive modulation［J］. Neuroscience, 1994,63(2):533-546.