PEI-氧化铁磁性纳米颗粒作为基因载体的实验观察

　　作者：陈道桢, 薛文群, 龚健, 詹惠英,汤月萍, 吴高雄, 王家俊    作者单位：南京医科大学附属无锡妇幼保健院中心实验室，江苏 无锡 214002

　　【摘要】目的: 评价氧化铁磁性纳米颗粒(MNPs)作为体外基因载体的可行性及外加磁场对于其转染效率的影响. 方法: 以FeCl3水溶液作原料,采用部分还原沉淀法制备纳米磁性颗粒,并用聚乙烯亚胺（PEI）对其进行表面修饰. 利用电镜、X射线衍射、 琼脂糖凝胶电泳等手段对MNPs的形貌、粒度分布、物相组成、DNA结合能力等进行表征. 应用荧光素酶报告基因系统,检测MNPsPEI将外源基因转染至不同细胞系的转染特性以及外加磁场对基因载体效率的影响. 结果: MNPsPEI 可将外源基因转染至多个细胞系并高效表达. 不同细胞系的转染效率和时间各不相同. 外加磁场可使转染效率提高4～5倍. 结论: PEI修饰的磁性纳米颗粒是一种可用于体外转染的新型非病毒基因载体,外加磁场可提高其转染效率.

　　【关键词】  磁性；纳米粒子；转染；磁场

　　Feasibility of magnetic nanoparticles  modified  by PEI as gene vector

    CHEN DaoZhen, XUE WenQun, GONG Jian, ZHAN HuiYing, TANG YuePing, WU GaoXiong, WANG JiaJun

    Central Laboratory, Wuxi Hospital for Maternal and Child Health Care, Nanjing Medical University, Wuxi 214002, China

    【Abstract】 AIM: To evaluate the feasibility of magnetic nanoparticles  (MNPs) as gene vector and the effect of magnetic field on efficiency of transfection. METHODS: MNPs were prepared by controlling some chemical reaction parameters through partial reduction/precipitation method with ferric chloride aqueous solutions as precursor material. The surface of particles were modified by polythylenei (PEI) agents. The appearance, the size distribution,  structure and pHase constitute of MNPs were characterized by transmission electron microscopy and Xray diffraction; the potential of adsorbing DNA of MNPs was analyzed by electrophoresis;  Transfection was determined by delivering reporter gene, PGL2control encoding luciferase, to different cell lines using MNPsPEI as vector. The effect of magnetic field on efficiency of transfection was determined using NdFeB permanent magnet. RESULTS: Foreign gene could be delivered to various cell lines by  MNPsPEI and expressed with high efficiency, but the transfection efficiency and time course varied in the different cell lines studied. Magnetic field could enhance the efficiency of transfection by 5～10 folds. CONCLUSION:  MNPsPEI can be used as a novel nonviral gene vector in vitro, which offers a basis for gene delivery in vivo.

    【Keywords】 magnetic; nanoparticles (MNPs); transfection; magnetic field

　　0引言

    在肿瘤基因治疗的临床试验研究中,有三分之二采用病毒载体. 但病毒载体存在诸多缺陷［1］,因此,人们逐渐将注意力转向非病毒载体. 传统的非病毒载体大部分为多聚阳离子聚合物和脂质体的衍生物,其最大的缺陷是基因转移效率低,尤其在体内,容易被细胞内外的水解酶消化,而且缺少组织特异性,并具有一定的细胞毒性. 为克服非病毒载体的缺陷,有研究者提出应用无机纳米颗粒作为基因载体的设想. 比较目前的非病毒载体,无机纳米颗粒具有纳米效应,几乎没有细胞毒性,可以抵御消化酶的消化. 本研究首先以FeCl3水溶液作原料,采用部分还原沉淀法制备磁性纳米颗粒,并用PEI对其进行了表面修饰. 再应用荧光素酶报告基因系统,检测MNPsPEI将外源基因转染至不同的细胞系的转染特性以及外加磁场对基因载体效率的影响.

    1材料和方法

    1.1材料非洲绿猴肾细胞系COS7 细胞、小鼠成纤维细胞系NIH/ 3T3细胞、人类宫颈癌细胞系Hela细胞、小鼠细胞系MA782/5S8102细胞,由本室冻存和复苏,培养于含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640 培基,置于50 mL/L CO2的培养箱中. PGL2control质粒和荧光素酶检测试剂盒购于Promega公司(美国).  葡聚糖、氯化亚铁、氯化铁、氨水等化学试剂均为分析纯,购自化学试剂公司. 细胞培养用试剂RPMI1640和小牛血清购自Gibico公司(美国); 聚乙烯亚胺和BCA蛋白定量试剂盒购自Sigma公司(美国).

    1.2方法

    1．2．1MNPs制备与表面修饰在500 mL三颈瓶中加入一定量1 mol/L FeCl3溶液,用蒸馏水稀释至约100 mL,在150 mL烧杯中加入一定量0.5 mol/L Na2SO3溶液,用蒸馏水稀释至约100 mL,然后加入滴液漏斗,滴加至烧瓶中；滴毕,在剧烈搅拌下将氨水溶液快速滴入烧瓶中,即可见黑色沉淀,调节pH值到达8左右,反应趋于完成. 在60～80℃水浴中加热30 min后,将产物磁分离、洗涤和真空干燥.  将上述 MNPs分散于含有一定PEI的分散系中,用恒温磁力搅拌器搅拌数小时,使反应充分,形成稳定的具有核壳结构的MNPs. 用磁分离法,将MNPs从溶液中分离出,并用蒸馏水、甲醇等反复洗涤,真空干燥后得到表面修饰过的MNPs存放在干燥皿内待用.

    1.2.2分析表征用X射线衍射(XRD)对修饰前后MNPs进行物相分析；HITACHI 800透射电镜(TEM)分析MNPs修饰前后的形貌和粒度分布.

    1.2.3DNA体外结合在不同的酸碱度下,将MNPsPEI与PGL2control质粒DNA按30∶1混合,同时在pH=7时,将MNPsPEI与质粒DNA按不同的比例（0∶1，10∶1，30∶1，50∶1，100∶1，150∶1）混合, 其中DNA的浓度恒定为10 mg/L，混合物在4℃静置1 h后,分别取产物进行琼脂糖凝胶电泳80 V，2 h，凝胶成像系统观测并照像.

    1.2.4体外转染将1×105细胞种于6孔板中. 24 h后,用无血清的1640培养基洗2次,在无血清的1640培养基下,每孔中转染 PGL2control表达质粒约2 μg. 将MNPsPEI和质粒DNA按50∶1的质量比混合后震荡10 s,加至单层培养的细胞上. 转染后5 h加入含150 mL/L小牛血清的1640培养基,在转染的不同时间收获转染PGL2control的细胞,用 PBS洗2次,用裂解液裂解细胞,用细胞刮子将细胞刮下,震荡约20 s, 4000 g离心1 min. 收集上清, 加20 μL上清至荧光素酶检测底物(Luciferase Assay Substrate, Promega公司)中,用单光子检测仪检测荧光素酶的活性. BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，计算每mg蛋白中的相对荧光素酶活性(RLU). 外加磁场组,将强磁块置于已加入MNPsPEI/DNA复合物(质量比30∶1)的6孔板下转染0.5 h,其余步骤同上.

    2结果

    2.1表征结果经XRD分析, 该粉末的XRD主峰与Fe3O4(19-629)非常接近,因此,MNPs的主要物相为Fe3O4. 从图1可以看出,MNPs分布均匀,具有一定的分散性. 其粒径大致呈正态分布,主要集中在5～25 nm(占97%)区域，其中10～20 nm的颗粒占76%.

    图1MNPs的电镜下的形貌×50 000

    2.2DNA结合实验琼脂糖凝胶电泳显示，在酸性和中性的条件下，MNPsPEI具有结合DNA的能力，电泳显示为DNA不移动或移动速度降低. 但是在碱性的条件下，DNA结合能力差. 在MNPsPEI和DNA的质量比为30∶1时，不同酸碱度条件下，MNPsPEI和DNA的结合情况,在pH=3时，MNPsPEI和DNA的结合力强，电泳显示DNA泳动速度慢，与MNPsPEI结合的DNA未出孔，未显示出游离的DNA(图2). 在pH=10时，MNPsPEI和DNA的结合力弱，在相应的泳道上可见明显的DNA条带. 观察琼脂糖凝胶电泳图可以得知，从30∶1开始，PEI修饰后的锰锌铁氧体磁性纳米粒便能与DNA有效结合（图3）,凝胶上已无明显DNA条带；按0∶1, 10∶1加入质粒的，泳道上可见清晰的DNA条带.

    1: 对照质粒DNA; 2: pH=10; 3: pH=7; 4: pH=3.

    图2不同酸碱度条件下PEI修饰后的锰锌铁氧体磁性纳米粒结合DNA实验

    2.3体外转染实验MNPsPEI能将外源质粒PGL2control转染至以上各细胞系,但转染效率及表达的时效各不相同(图4). MNPsPEI具有直径约10 nm的磁性Fe3O4的晶体核,具有超顺磁性. 将永磁块置于转染细胞培养板下. 结果显示,不同细胞系外加磁场后,转染效率均提高了4～5倍(图5).

    1: Marker; 2: 150∶1; 3: 100∶1; 4: 50∶1; 5: 30∶1; 6: 10∶1;  7: 0∶1.

    图3PEI修饰后的磁性纳米颗粒在与DNA不同质量比条件下的结合实验

    A: MNPsPEI转染PGL2control至COS7细胞系的时间效率关系; B: MNPsPEI转染PGL2control至NIH/3T3细胞系的时间效率关系; C: MNPsPEI转染PGL2control至HeLa细胞系的时间效率关系; D: MNPsPEI转染PGL2control至MA782/5S8102细胞系的时间效率关系.

    图4MNPsPEI体外转运PGL2control的时间效率曲线

    图5外加磁场对MNPsPEI转染COS7细胞株效率的影响

    3讨论

    基因治疗的成功实施除了需要安全、有效的目的基因外,高效、安全的基因导入载体也是关键因素［2］. 目前常用的基因导入载体主要分为病毒型和非病毒型,病毒型载体虽然效率较高,但有诱导宿主免疫反应、潜在致瘤性、装载容量有限和费用高等问题;非病毒型载体因具有安全、低毒、装载容量大、操作简单等优势而引起广泛关注,但转染效率偏低［3］. 纳米基因导入载体属于非病毒基因导入载体一类. 纳米颗粒作为基因载体具有它的优点［4-6］. 阳离子聚合物纳米粒子与DNA的结合主要是通过电荷作用,当DNA与一种适宜的阳离子聚合物分子结合时,带负电荷的DNA 分子被缩合成浓缩、有序的、直径为50～200 nm的纳米粒子,这种粒子是非病毒阳离子聚合物载体超分子化学作用的基础. 研究认为,阳离子聚合物纳米基因载体与DNA形成的复合物是最有前途的非病毒基因导入载体系统之一［7］.

    PEI是人工合成的含有极高密度正电荷的有机大分子阳离子聚合物. 研究证实, PEI在体、内外均有较高的转导效率［8］,但缺乏靶向性. 磁性氧化铁纳米颗粒为目前国内外导向药物和医用纳米材料研究的最新成果,除具有一般纳米颗粒的优点外,还具有超顺磁性,在外加磁场作用下,可引导负载物质定向移动、定位浓集,从而进行靶向基因治疗［9］. 曾有研究用葡聚糖包裹氧化铁形成的纳米颗粒用于基因载体研究,但转导效率偏低［10］.

    本研究应用PEI有结合、保护DNA的功能和磁性纳米材料的磁导向功能,用PEI包裹的氧化铁磁性纳米颗粒作为基因载体进行体外基因转染实验,试图寻找一种能集结合、保护DNA和靶向性于一体的、安全、高效的新型基因载体. 电镜观察发现, MNPsPEI颗粒的粒径约10 nm, 颗粒均匀. MNPsPEI的DNA结合实验证实, MNPsPEI具有良好的结合DNA功能. 体外基因转染实验发现, MNPsPEI能将PGL2control质粒DNA导入肿瘤细胞中, 进而表达荧光素酶,而外加磁场后转染效率可增加几倍. 因此,磁性转染可能成为提高基因导入载体转染效率的有效方法之一. 我们认为,磁场使PEI包裹的氧化铁磁性纳米颗粒转染效率升高的主要原因,可能是磁场作用使悬浮的磁性基因载体更易、更多地到达细胞表面,从而使更多的基因载体进入细胞中,因此, MNPsPEI有可能成为体外基因转染的良好载体. 国内外学者研究也认为［11-12］,磁性转染是克服载体聚集慢和在靶组织浓聚低的较合适的方法. 把PEI等基因导入载体与磁性纳米颗粒结合,不仅可提高转染效率,增加基因的表达水平,而且可使所需载体的用量减少,从而达到减轻毒性和降低费用,并且获得有效转导所需时间也缩短. 此外，氧化铁磁性纳米颗粒容易制作,粒径可达10 nm以下,细胞毒性小,可以被细胞吞噬,而且具有超顺磁性. 尤其肿瘤组织的血管内皮细胞间隙增大, 氧化铁磁性纳米颗粒容易通过血管内皮被肿瘤细胞吞噬. 目前, 氧化铁磁性纳米颗粒已被广泛应用于核磁共振的造影剂,尤其是肿瘤的核磁共振成像的研究［10,13］. 我们认为氧化铁磁性纳米颗粒的特性也符合基因载体的要求,尤其可用于肿瘤的基因治疗. 因此,把PEI与磁性纳米颗粒结合而形成的新型基因导入载体具有极大的应用前景. 本研究从体外证实了MNPsPEI作为基因载体的可行性,同时应用外加磁场,有效地提高了转染效率. MNPsPEI这种制作简单、成本低廉的物质,有望成为目前基因转染载体的良好替代品,并用于体内的基因治疗.

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