（本文作者：国家沈阳新药安全评价中心 苏来等）
DNA 交联是外来化学物作用于DNA 所致的重要遗传损伤, 与其他类型DNA 损伤相比, DNA 交联较难修复或易于发生易错修复, 在细胞周期中维持时间较长。DNA-蛋白质交联(DPC)的存在阻滞了DNA 的正常转录和复制, 会导致染色体断裂、缺失,基因突变和细胞的死亡。因此WHO 指出DPC 可以作为机体潜在突变的分子标志物。故筛检环境化学物的DNA 交联性损伤具有极其重要的意义。
然而, 由于检测方法的局限, 极大地制约了其应用。近年来, 国外常有将彗星实验(Comet assay)用于检测DNA 交联的报道, 而国内却很少见,几乎都是用KCl-SDS 沉淀法进行检测, 但此方法费时且成本较高。本室在深人挖掘彗星实验的应用前景时, 首次探讨了通过添加蛋白酶K 来检测DNA交联的新思路, 现报道如下。
1 材料和方法
1.1 检测原理
彗星实验检测单个哺乳动物细胞DNA 链断裂的原理是: 化合物作用于细胞DNA 造成链断裂, 形成大量带负电荷的DNA 断片, 在电场作用下, 断片离开主核向阳极迁移, 经荧光染料染色, 其形状如同彗星。在一定条件下彗星尾的长短可反映DNA 损伤的大小。我们在用彗星实验检测外来化合物对小鼠肝细胞遗传损伤的研究时, 发现在实验过程中添加蛋白酶K 会显著增加彗星的尾长和彗尾DNA 含量。基于这一原理, 不难设想, 如果细胞存在DNA-蛋白质交联, 那么通过添加一定量的蛋白酶K, 可使单细胞在电泳时产生更大的迁移, 利用添加蛋白酶K 前后的彗星尾距比可以快速有效地判断外来化合物在对生物机体产生DNA 损伤效应的时候, 是否出现DNA-蛋白质交联作用。同时还可以通过比值的大小反映DNA-蛋白质交联作用的强度。
1.2 小鼠肝细胞悬液的制备及染毒方案
将实验动物用乙醚麻醉解剖后, 迅速取出肝脏,用眼科剪剪成麋状(约1 mm*3 的组织块), 用2 层擦镜纸过滤, 将得到的细胞悬液均匀分装到5 个离心管中, 并分别加不同浓度的甲醛溶液, 使甲醛的最终浓度分别为0、5、25、125 和625 μmol/L。然后将5 组离心管放入37℃水浴中, 染毒1 h。设计每个染毒组分别做6 个样品。
1.3 离体细胞数量及死亡率的测量
用苔盼蓝排斥法检测离体细胞活力。细胞存活率接近90%。细胞密度约为105~106 个/mL。
1.4 彗星实验
彗星实验作为经典的DNA损伤检测工具, 其实验步骤相对固定, 各实验室之间的差异不大。简单概括为: 在载玻片上先铺一层0.8%的正常熔点的琼脂糖(NMA), 待凝固后再铺一层含有细胞悬液的0.8%的低熔点琼脂糖(LMA), 然后将凝固好的载玻片放到裂解液(2.5 mol/L NaCl, 100 mmol/L EDTA,1% Triton X-100, 10 mmol/L Tris, 1%十二烷基肌氨酸钠, pH = 10, 用前加入1%体积的Triton X-100,10%二甲基亚砜)中, 在4℃下避光裂解2 h。之后将玻片置于电泳缓冲液(1 mmol/L EDTA, 300 mmol/LNaOH, pH > 13)中, 避光静置20 min, 使双链DNA在碱性条件下解旋成单链, 然后调节电压为18 V,电流300 mA, 避光电泳20 min。电泳结束后, 将载玻片放入中和液(0. 4 mol/L Tris, pH = 7. 5)中, 中和30 min。之后用甲醇固定, EB 染色。为了避免额外的DNA 损伤, 以上所有步骤在暗处或弱光下进行。24 h 内荧光显微镜下观察并拍照。
1.5 DNA-蛋白质交联检测裂解后, 用TE 缓冲液(10 mmol/L Tris, pH 10,1 mmol/L EDTA)冲洗载玻片(5 min, 4℃)。添加0.5 mg/mL 的蛋白酶K 37℃水浴过夜。其余步骤同彗星实验。将所得细胞尾距与未添加蛋白酶K 的进行比较。
1.6 数据统计分析
运用CASP 彗星图像分析软件(从http://www.casp.of.pc/下载)分析由数码相机拍摄的单个细胞电泳图片, 检测指标为国际公认的尾DNA(Tail DNA)和尾距(Tail moment)。单细胞凝胶电泳实验测得数据用SPSS13. 0 统计软件分析。
2 结果与分析
2.1 甲醛彗星实验检测结果
小鼠肝细胞与不同浓度甲醛孵育1 h 后, 在低浓度(5 μmol/L)水平时, 甲醛对小鼠肝细胞DNA 的损伤以DNA 断裂为主。如图1 所示, 当甲醛溶液浓度为5 μmol/L 时, Tail moment 和Tail DNA 都较空白对照组有极显著的提高(P < 0. 01), 当甲醛溶液浓度升高到25 μmol/L 时, Tail moment 和Tail DNA 都开始下降, 并且与空白对照组相比无显著差异性; 但当甲醛溶液浓度升高到125 和625 μmol/L 时, Tailmoment 和Tail DNA 相对于空白对照组有极显著下降(P < 0. 01)。由此推判, 甲醛在低浓度(5 μmol/L)时, 能显著导致小鼠肾细胞的DNA 断裂(P<0. 01);而随着甲醛浓度(25、125、625 μmol/L)的升高, 又导致了DNA 的交联效应, 并具有明显的剂量效应关系。此实验结果与Oliver Merk 及徐钱等人所得研究结果一致。
2.2 甲醛蛋白质交联检测结果
用本文所述实验方法检测DPC 发现, 经添加蛋白酶K后, 各处理组细胞的DNA尾距都有一定程度的增加, 尤其在较高浓度(125、625 μmol/L)水平时,增加的尾距很明显。这提示在高浓度下出现了DNA-蛋白质交联(DPC)效应。
2.3 其他交联剂检测结果
为了探讨该方法是否可广泛用于DNA-蛋白质交联的检测, 我们还对尿素醛(DZU)、顺铂这些强交联剂也进行了同样的实验(表1)。
表1 彗星实验中不同交联剂的DNA 迁移效果
3 讨 论
DNA 交联(DNA crosslinks)是外来化学物作用于DNA 所致的重要遗传损伤。DNA 交联的检测可作为一种短期生物实验, 测试化学物的潜在遗传危害和致癌性, 并在一定程度上阐明致癌作用的机理。目前, 检测DNA 交联的方法很多, 但现有方法中有的敏感性和特异性差, 有的需要制备特异抗原和昂贵的仪器设备, 还有的必须使用放射性同位素,且样品处理十分复杂耗时。因此迫切需要研究一种简便、快速、经济灵敏度高又便于推广的DNA 交联检测方法。
甲醛具有广泛的遗传毒性。研究证实, 甲醛可以导致DNA 链的断裂、DNA-DNA 的交联(DNA-DNA crosslinks, DDC) 以及DNA-蛋白质的交联(DNA protein crosslinks, DPC), 染色体的畸变、姐妹染色单体的交换等。其主要和直接的遗传毒性效应是形成DPC, 因此学者们将DNA-DNA、DNA-蛋白质分子交联作为甲醛潜在突变的分子标志物。甲醛所致的DPC 其共价键介于赖氨酸与DNA 碱基之间, 诱导的DPC 主要结构是组蛋白-CH2-DNA。在正常的细胞中存在着一定量的DPC,它是DNA 与核蛋白正常联系或代谢的结果。如果机体内的大分子物质受到外来的理化因素(如甲醛)的作用, 则可以诱导出超量的DPC, 从而对DNA 的构象与功能产生严重影响, 进而影响DNA的复制与转录。与其他的DNA 损伤相比, DPC 较难修复, 在DNA 复制过程中易造成一些基因如抑癌基因等丢失, 导致肿瘤的发生。
本室在对彗星实验检测DNA断裂的基础上, 对彗星实验检测DNA 交联进行了较为系统的研究。国内外用彗星实验检测DNA 交联时, 使用的原理是:在实验系统中加入一个标准的DNA 断裂剂, 若受试物可以降低断裂荆所诱导的DNA 迁移或完全阻止其迁移, 说明该受试物具有DNA 交联作用。另外国内也有报道是通过增加电压或延长电泳时间,使得空白对照出现DNA 迁移而受试物组的迁移比空白对照组短或完全无迁移, 从而推导该受试物具有DNA 交联作用。我们所报道的实验则是通过添加一定量的蛋白酶K, 可使单细胞在电泳时产生更大的迁移, 利用添加蛋白酶K 前后的彗星尾距比可以有效地判断外来化合物在对生物机体产生DNA损伤效应的时候是否有出现DNA-蛋白质交联作用。同时还可以通过比值的大小反应DNA-蛋白质交联作用的强度。
从图1 和图2 可见, 用这种实验方案检测DNA交联时, 蛋白酶K 的添加是实验的关键步骤。我们通过反复实验比较, 发现蛋白酶K 的浓度最好不要低于0.5 mg/mL, 否则在高浓度处理实验中, 不能很好的检测到DPC 效应。此外, 在实验中添加的TE并不影响实验, 即不会额外增加细胞的尾距, 而且在各浓度中是作为常数存在的。
除了对肝细胞进行研究外, 我们还对其他组织或器官(如血、肾)进行了实验, 结果都能很好的说明甲醛等强交联剂引发的DPC 效应。因此, 根据实验结果, 我们认为采用这种方法进行DPC 检测具有更简便、快捷的优点, 因为实验系统中不需加入标准DNA 断裂剂, 或交联剂。其次, 现在国内在进行蛋白质交联的测定时多数使用KCl-SDS 沉淀法, 该方法与作者推荐的方法有异曲同工之处, 实验中都有添加蛋白酶K, 不同的是前者测定结合蛋白质的DNA 占总DNA 的量, 后者通过比较添加蛋白酶K后的实验结果就可以快速判断受试化合物是否具有蛋白质交联作用, 并可以大致确定出现交联作用的化合物浓度范围。再次, 实验简单, 整个实验几乎与彗星实验同步进行, 只是在裂解之后多了一步——添加蛋白酶K, 因此, 在相同实验条件下, 可以通过彗星实验同时观察到两项实验指标, 即是否有DNA断裂损伤作用及作用的大小及浓度范围和是否有DNA-蛋白质交联作用及作用的大小及浓度范围。
但不可回避的是该方法目前只能用于DNA-蛋白质交联的检测, 而对于DNA-DNA 交联的检测还需进一步研究。这种方法虽然简便、新颖, 成本低廉, 但其使用价值和一些细节问题还值得深人研究。
