（本文作者：解放军总医院第一附属医院烧伤整形科 贾晓明）
据统计,目前世界每年大约有100万人因各种原因而烧(烫)伤。尤其大面积深度烧伤病人,治疗是一个漫长而复杂的过程。通常需要通过异体(种)皮片移植来覆盖创面,而皮源的缺乏往往成为治疗的关键问题之一。
54年前英国人Pickerill写下了这样一段话:毫无争议,创伤整复手术成功的关键之一是有可供给的皮源覆盖因创伤带来的大面积皮肤缺损。实际上在某种情况下,对皮源的需要超越一切。因此这启示我们应该注重皮肤的储存与临床应用。
解放军总医院烧伤整形医院皮库自1973年创建皮库以来,分别运用了4℃、- 20℃和- 80℃低温冰箱皮肤保存法以及液氮储皮方法。1987年开始速冻玻璃化储皮方法储存的实验研究和临床应用。每年异体尸体皮采集及储存40余具,深低温速冻异体皮保存方法的改进使保存皮片活力稳定保持在70%以上,皮片移植成活率达95%以上。现已成为亚洲最大的皮库之一,已储存了1500余具活力良好的尸体皮,供全国25个省市200多家医院使用,每年创利润数百万元,经济效益显著。解放军总医院烧伤整形医院皮库在科研方面曾获国家自然科学基金,八五、九五、十五全军科研基金10余项;出版相关专著10余部,发表学术论著100余篇;培养进修生、研究生近百人,获国家科技进步二等奖1项,军队科技进步二等奖5项。
一、皮肤的低温储存
1. 皮肤储存的基础知识:皮肤的结构:皮肤从外到内,由表皮、真皮和皮下组织三部分组成。皮肤附件作为特化的表皮结构也属于皮肤的重要结构,其中包括汗腺、皮脂腺、毛发、指甲。表皮从上到下又分为角质层、透明层、颗粒层、棘层、基底层。真皮分为乳头层、网状层。主要有结缔组织构成,包括胶原纤维、弹力纤维、网状纤维。此外皮肤附件,血管、淋巴管、神经末梢。皮肤的主要功能有保护作用、感觉作用、体温调节作用、分泌和排泄作用、吸收作用。大面积烧伤病人创面焦痂的存在引起:体液的丢失、有害介质释放、侵袭性感染的滋生地、机体超高代谢、多器官功能衰竭及并发症。
2. 皮肤储存的必要性: ①当大面积烧伤或皮肤缺损超过体表面积的30%时,自体供皮受限; ②临床实践证明:具有活力的异体皮仍是目前最为理想的创面覆盖物; ③异体皮来源时间受限。
3. 皮片的来源及种类: ①自体皮,烧伤治疗中最为常用的皮片,其来源受到供皮区的限制; ②异种皮,以猪皮多见,取材方便,但移植后排斥时间短,有时难以达到覆盖创面的目的; ③同种异体皮,主要来源于成人新鲜尸体,其次为新鲜死婴皮。
4. 皮肤的低温储存理论依据:理论上,储存温度越低,储存物活力保持的时间越长,细胞组织代谢越低,污染的细菌也不易繁殖。
低温损伤机制:低温保存关键在于解决低温损伤对生物组织的影响。经典的低温生物学认为在低温条件下,细胞主要受到来自两种因素的损伤即溶质性损伤和胞内冰损伤,即“两因素”假说。
胞内冰晶损伤,胞内生成冰晶,长大到一定程度,引起细胞壁及细胞内超微结构的变化,甚至导致细胞死亡,是降温速率较快时引起损伤的主要原因。溶质性损伤(高渗性损伤) ,细胞外水分结冰,导致细胞内外溶液浓度的升高并持续较长的时间。由高渗引起细胞的损伤,是降温速率较慢时引起损伤的主要原因。
皮肤不是单细胞成分,而是由表皮和真皮构成的复合组织,由于皮肤内的各种主要细胞成分的结构与功能的复杂性,各种细胞代谢与营养条件不同,对环境改变的适应性亦有所不同。因此皮肤的低温损伤是一个更为非常复杂的过程。低温损伤的干预包括玻璃化储皮方法的发展和抗冻液的使用。
5.玻璃化的基础知识:玻璃化是一个物理学的概念,是指当水或溶液在极快降温到或低于- 100℃～ - 110℃的温度范围时,形成一种具有高黏度的界于液态和固态之间、非晶体态的、杂乱无章的、透明的玻璃状态。玻璃化储存生物组织和细胞,由于降温速率很快,水分没有足够的时间来形成冰晶,即进入均匀的玻璃状态。这种玻璃态的物理性能与晶体态不同,是一种既可以避免或减轻冷冻过程组织的损伤,又是同时可长期保存组织的良好方法。皮肤在- 196℃的深低温环境中,其组织和细胞内各种酶的活力及代谢很低甚至近乎零,即所谓的生命悬持状态。在此温度下保存的皮肤理论上可无限期储存。玻璃化的理想条件理论上说,体积很小的1微升纯水要用106～107℃/ s降温速率才能形成玻璃态。
皮肤玻璃化储存的途径:以水为主要成分的生物组织,实现完全玻璃化需要极高的降温速率。目前只能采用各种方法实现部分玻璃化,抑制冰晶形成和长大,避免细胞严重损伤。目前国内各家皮库主要采用液氮作为冷源,温度可达-196℃,皮片直接放入液氮后,其最快的降温速率可达2160℃/min。储存的皮肤往往因具有一定的厚度和面积带来冷源温度传导困难和储存不便,因此可设计成皮卷形式。冷却的铜板预冷皮肤后即将其直接浸入液氮。深低温储存组织离不开抗冻液的保护,否则皮肤将受到严重的损伤。抗冻剂的作用机制有以下两点:有效抑制过冷水的不规则形态及促进快速结晶,促进玻璃化行程;缓冲因冰形成而造成的渗透压升高,减轻溶质损害。
目前较为成熟抗冻液配方: H液( 20%二甲基亚砜、6%丙二醇) ,以此作为玻璃化储存皮肤的抗冻液。一般10000 cm*2 面积的皮肤约需抗冻液3000 ml。玻璃化储存皮肤的步骤: ( 1)异体皮的采集; ( 2)消毒; ( 3)皮肤的修整; ( 4)抗冻液的处理; (5)包装; (6)快速降温; (7)液氮容器的管理。玻璃化对皮肤结构和功能的影响: (1)细胞膜的影响:降低细胞的流动性,细胞骨架受损,表皮细胞黏附率降低,基底膜的破坏; ( 2)玻璃化对皮肤抗原性影响: ①皮肤经低温储存后,异体皮的存活时间较新鲜异体皮长; ②低温储存后皮片抗原性降低,可能与皮肤内朗格汉斯细胞(LS)数量降低有关; ③保存温度越低,抗原性越弱,移植后存活时间越长。
常用的皮肤活力的鉴定方法有皮肤氧耗量测定法、琥珀酸钠脱氢酶测定法、四氮唑盐WST21法和SYTO /EB双重染色法。
皮肤氧耗量测定法原理:有活力的组织均有代谢耗氧。恒温营养液内微电极(铂、银电极)与有活力的皮肤接触,表面氧分压下降,通过放大器测下降程度,推算出皮肤的活力,操作可在1 h内完成四氮唑盐WST21法原理:利用活组织或细胞中的线粒体琥珀酸四氮唑反应体系(RS) ,作用在亚细胞呼吸链反应中的还原型辅酶Ⅰ (NADH) 、NAD + (辅酶Ⅰ) 脱氢反应与细胞组织中的呼吸链EC (电子耦联反应体系) 结合,将H结合到WST-1 的甲氮唑苯环上,打开其四氮唑苯环而显色。
SYTO /EB双重染色法为一种敏感、快速的皮肤活力检测法,采用新型穿透性核酸染色剂SYTO和EB 。方法:皮片经PBS洗涤后加入SYTO 50ul, 37℃避光孵育30’, PBS洗涤加入50 μlEB,水浴避光孵育30’后PBS洗涤。通过488 /520nm激发,在荧光显微镜下观察。
玻璃化对皮肤活力的影响:通过对氧耗量及琥珀酸脱氢酶活力的测定发现玻璃化储存的皮肤活力较慢冻法提高了将近20%。
速冻玻璃化储皮的优点及效果:该法可以永久保存皮肤,储存后冷冻皮片的平均活力指标可达到新鲜皮片的70% ,较以往的慢速冷冻法提高活力近20%。采用该法保存的皮肤临床具有质地柔软、植皮后转红快、成活率高(95%左右) 、存活期长等优点。
二、皮肤储存技术临床实际应用
冷冻异体皮的适用范围是开放性创面、深度烧伤创面和切痂创面的暂时性覆盖;用于邮票、网状或自体微粒皮的覆盖移植,保证下方自体微粒皮成活;用于自体皮源紧张的烧伤后期整形重建手术,作为自体微粒皮的支架;用于暂不适合自体皮的创面覆盖以改善创基情况。
异体皮覆盖创面的意义:防止创面干燥,减少水分及热量丧失;防止电解质、蛋白质及血细胞丢失;减少创面污染,减轻患者疼痛;有利于关节部位早日活动;保护暴露的组织,促进肉芽成熟、创面愈合,具有抗感染能力;低温储存后抗原性降低,创面覆盖时间延长。
应用方法有两种:大张异体皮嵌植小块自体皮和大张异体皮自体微粒皮移植。目前临床应用较多的是第二种方法。大张异体皮+微粒皮制备方法:第一步,复温;第二步,微粒皮的制备;第三步,漂皮。
微粒皮植皮注意事项: ( 1)植皮面积与微粒皮比例,自体微粒皮与异体皮的比例为1∶10～1∶15较好. 自体皮源极度缺乏时甚至可达1∶20; ( 2)微粒皮正反面问题; (3)微粒皮均匀分散。
皮肤低温储存的基础研究进展:皮肤细胞外基质(纤维连接蛋白、层粘连蛋白等)及骨架蛋白(微丝、微管、中间丝)可能是低温损伤的关键位点;新型抗冻剂海藻糖的发现,可进一步优化低温抗冻液配方;皮肤替代物的研究,寻求理想的皮肤替代物一直是烧伤外科的重要课题。
深低温皮肤储存的技术为临床救治大面积烧伤病人创面覆盖工作的顺利开展提供了有力的支持。但目前仍有一些不可忽视的问题存在,如降温速率并不十分满意,抗冻剂的进一步筛选;异体皮传播肝炎病毒、HIV的可能性;异体皮来源受到极大的限制;排斥问题的存在,排异组织溶痂及加重病情等。
随着皮肤低温储存研究的不断发展,从而更为有效的提高异体皮活力,同时通过对皮肤替代物研究的加强,相信大面积烧伤患者皮源匮乏的问题将得到进一步解决。
