单倍型造血干细胞移植的新进展及其临床结果

 关键词：造血干细胞       
（本文作者：解放军北京军区总医院 陈惠仁）
   
0 引言
    异基因造血干细胞移植对大部分恶性血液病及遗传性疾病是能彻底根治的主要方法，人类主要组织相容性抗原匹配供者，无论是血缘与非血缘相合供者，都是异基因造血干细胞移植最佳选择，在完善的骨髓库中，可以获得30%人类主要组织相容性抗原相合非血缘的供者，国内单生子女国策，不足10%的患者可以获得相合亲缘供者，限制了造血干细胞移植应用，如果进行单倍型移植，无疑它将解决缺乏供者的困惑。父母、兄妹和子女亲缘供者，作为造血干细胞移植的供体，彻底解决干细胞来源问题。
    1 问题的提出
    问题1：人类主要组织相容性抗原匹配供者，无论是血缘与非血缘相合供者，都是异基因造血干细胞移植最佳选择，但当缺乏人类主要组织相容性抗原匹配供者时，人类主要组织相容性抗原不合的移植将会发生哪些后果？
    问题2：10年来随着分子生物学、免疫学、药理学和细胞生物学技术的发展，国内外在人类主要组织相容性抗原单倍型移植方面都取得了一定的进展，国内外关于此方面的治疗方式有何不同？治疗效果如何？
    问题3：异基因造血干细胞移植后复发，目前尚无很有效解决方法。然而对于移植前疾病状态较差的患者，复发是移植失败主要因素。如何有效控制或治疗移植后的复发问题？
    2 问题的解决
    2.1 问题1：人类主要组织相容性抗原单倍型移植的三大屏障
    主要障碍是移植后移植物抗宿主反应、植入物排斥和移植后免疫重建迟缓，供受者之间的人类主要组织相容性抗原免疫遗传学差异是引起移植物抗宿主反应和宿主抗移植物反应的主要发病因素，同人类主要组织相容性抗原配型相合移植比较，存在造血重建慢、移植物抗宿主反应严重、免疫重建迟和移植相关死亡高等诸多问题。西雅图在20世纪80年代初尝试应用人类主要组织相容性抗原配型不合移植治疗的可行性，严重的急性移植物抗宿主反应的发生率达75%以上，早期临床结果不甚令人满意，由于高死亡率,西雅图骨髓移植中心不推荐未去T细胞的单倍体相合骨髓移植。然而清除T细胞单倍型移植技术虽减轻重度移植物抗宿主反应发生,但移植物排斥率达20%~70%,加上去除T细胞移植后免疫功能恢复迟缓及移植物抗白血病作用减弱,移植后严重感染和复发率均增加,未改善白血病的无病生存，移植同样是失败的。
    2.2 问题2：国内外单倍型移植取得的进展和临床结果
    近年来通过使用抗胸腺细胞球蛋白、氟达拉滨、甲强龙和全身照射使人类主要组织相容性抗原单倍型骨髓移植排斥率由40%降到0~5%，South Carolina大学报告预处理用抗胸腺细胞球蛋白，210例移植患者植入率是97%，在预防移植物抗宿主反应方面，体内和体外去T相结合，体外加抗体T10B9，选择性去处引起移植物抗宿主反应的T细胞，移植后使重度移植物抗宿主反应发生由70%降至10%~20%，临床经验支持选择去除T细胞有利于单倍型移植的成功。近年来Clin MACS对CD34阳性细胞筛选，在单倍型移植中CD34细胞数达到10×10*6/kg以上，除快速重建造血外，并有特异杀伤自身主要组织相容性复合物类抗原的细胞毒前体细胞，克服宿主抗移植物反应，增加植入。Aversa 研究小组大剂量CD34细胞与相对低毒性的抗胸腺细胞球蛋白、氟达拉滨、塞替派使用，使90%以上患者持续植入，1月内移植相关死亡10%。使用ClinMac在分离纯化CD34细胞可去除4~5个对数T细胞，在移植物中CD3细胞仅为（1~5）×10*4/kg水平，提高了临床结果，2005年临床研究评价最新101例结果，94/101例取得稳定植入，38例非白血病死亡，在缓解状态的急性髓细胞白血病和急性淋巴细胞白血病患者移植后无病生存是48%和46%。然而也有报告此方法不理想的结果，如加拿大WalKer等多中心研究完成11例报告，10例死于复发和感染。
  国内陆道培教授提出粒细胞集落刺激因子动员骨髓加外周血干细胞联合移植，延长的强化联合免疫抑制新方案预防移植物抗宿主反应，临床大宗患者报告和对比研究（HLA相合移植158例和人类主要组织相容性抗原不合移植135例比较），未使用照射，预处理中用阿糖胞苷及抗胸腺细胞球蛋白等，植入率达到100%，方法独特，不去T细胞又能控制重症移植物抗宿主反应，疗效显著，临床应用取得稳定的重复性，粒细胞集落刺激因子动员骨髓和外周血干细胞联合植入物中有核细胞的中位数是7.5(3.1~16.3) × 10*8/kg,CD3+ 中位数是177(15~991)×10*6/kg, CD34+细胞的中位数是2.3(0.2~9.7)×10*6/kg, 这组患者随访在6个月以上，均获重建造血，中性粒细胞> 0.5×10*9 L-1的中位天数是12天(范围10~25天),2例迟发性植入排斥，其中1例输入同一供者干细胞后获得第二次植活。125例取得血小板植活，血小板> 20×10*9 L-1的中位天数是15天(范围7~151天)，100天急性Ⅱ-Ⅳ度移植物抗宿主反应累计发生率为40%，相合移植组是32%，两组比较无显著性差异（P=0.13）。2年累计发生移植相关死亡是22%，相合移植组是14%（P=0.1），移植相关死亡的主要原因是感染和移植物抗宿主反应。2年累计发生复发是18%，相合移植组13%（P=0.4）。2年无病生存和总的生存是64%和71%，相合移植组是71%和72%，差异无显著性。临床方面结果人类主要组织相容性抗原半相合造血干细胞移植的屏障被克服， 人类主要组织相容性抗原不合（含半相合）移植的安全性已接近人类主要组织相容性抗原相合的造血干细胞移植。国内首次报告不去T细胞单倍型移植免疫重建明显快于去T细胞移植，降低移植后感染。对128例人类主要组织相容性抗原半相合移植，用全身照射10GY剂量，加用抗胸腺细胞球蛋白和阿糖胞苷预处理，127例植入，1例未植入，第2次增加干细胞数量的移植仍未植入。利用激活后T细胞表面的标记物，如CD25和CD69，这是引起移植物抗宿主反应同种反应T细胞的标志，用免疫磁珠方法筛选或用免疫毒素的药物杀伤有活性标记供者T 细胞，它显示永久去除具有活性标记供者T 细胞，但不影响供者静止的T 细胞和T 细胞的功能，选择性去除T 细胞移植增加移植成功，我们和Andre-Schmutz均在临床报告了抗IL-2α受体单抗在人类主要组织相容性抗原半相合移植中有效预防移植物抗宿主反应发生。Kaplan-Meier生存曲线计算2年无病存活达58.2%。2年实际无病生存率是46.6%。复发状态和进展期移植的患者2年无病生存是30.6%,标危组移植后生存率是65.5%,差异具显著性意义（P=0.043），增加病例数更加肯定CD25抗体预防移植物抗宿主反应结果，首次得出了长期随访的病例报告。最近几年，为了降低移植相关合并症，提出降低预处理强度单倍型移植，O'Donnell预处理用氟达拉滨降低强度，8/10例取得持久植入。在跨越人类主要组织相容性抗原不合植入屏障取得进展。
    在供者选择方面，取得了新的发现，母婴微小嵌合理论显示与降低单倍型移植移植物抗宿主反应有关，对35例的研究显示来自母婴微小嵌合理论的同胞供者较非遗传父系抗原同胞供者的单倍型移植移植物抗宿主反应发生率低，母婴微小嵌合理论的同胞供者较母亲母婴微小嵌合理论供者移植相关死亡少。杀伤细胞抑制受体配体不相容性与供者NK细胞克隆的异源反应性密切相关。Ruggeri观察到（Science 2002）单倍体去T细胞移植实验模型和临床试验，发现异基因反应性NK细胞输入和杀伤细胞抑制受体不合植入物提高移植后疗效，增加植入率，降低急性重度移植物抗宿主反应，减少复发率，在20例杀伤细胞抑制受体不合急性非淋巴白血病，无复发病例，无病存活率达60%，这些病例具备植入率高，急性重度移植物抗宿主反应降低的特点。这些研究帮助对供者的选择，提高单倍型移植的疗效。Ruggeri研究异基因反应NK细胞对慢性粒细胞白血病和急性髓细胞白血病具有潜在细胞毒活性，急性淋巴细胞白血病缺少NK结合靶细胞必需的黏附分子。异源反应NK 细胞活性是T细胞异源反应以外，具有显著抗白血病的自然免疫现象，利用这些认识到的免疫现象，可在慢性粒细胞白血病及急性髓细胞白血病治疗中，显示更佳疗效。
供者人类主要组织相容性抗原免疫重建的延迟，随着人类主要组织相容性抗原不合程度而加大，是影响预后的一个重要因素，受者在移植后相当时间内处在病毒，真菌及其他机会感染的高风险中， T细胞受体和人类主要组织相容性抗原不合，成人胸腺功能低下及长期细胞毒药物和免疫抑制对免疫功能造成的破坏，移植后对T细胞亚群及免疫功能研究，结果显示人类主要组织相容性抗原半相合移植免疫功能重建至正常低水平需要1~1.5年时间。IL-12在启动Th1,能对机会性感染后获得性免疫起重要作用。人类主要组织相容性抗原半相合移植后，粒细胞集落刺激因子使用，通过抗原提呈细胞作用阻断IL-12生成，它具有提升CD4细胞数量与功能作用，早期停用粒细胞集落刺激因子不失为加速免疫重建的良策。
    近年第三部分人类主要组织相容性抗原不合免疫细胞在骨髓移植作用很受重视，应用去T细胞自体骨髓、胎肝和胎胸腺及脐带血混合移植抗移植物抗宿主反应。国内率先成功进行双份脐带血在成人患者移植，无移植物抗宿主反应发生，国内外首先取得双份脐带血干细胞移植长期存活患者，提示在临床双份脐血移植是可行的，作为第三方人类主要组织相容性抗原不合细胞起着抗移植物抗宿主反应作用，国内会议报道人类主要组织相容性抗原不合脐带血作为第三方，联合人类主要组织相容性抗原不合造血干细胞移植，临床应用取得成功，降低移植物抗宿主反应，促进免疫耐受。最近特异免疫调节细胞引起重视，Tregs 是维系移植免疫耐受的必要细胞。Tregs可能参与移植物抗宿主反应 预防以及淋巴细胞恢复重建的调控。研究发现， 供者CD4+CD25+Treg能明显促进MHC不合的造血干细胞植入，通过观察粒细胞/巨核细胞集落形成单位等发现，CD4+CD25+Treg能明显提高移植后粒巨噬细胞集落形成单位,造血前体细胞集落形成单位的数量，通过检测嵌合体MHC表达等发现，CD4+CD25+Treg能促进供者造血干细胞在宿主体内长期存活。阐明CD4+CD25+Treg在单倍型骨髓移植的作用，这些问题的解决对降低移植物抗宿主反应的发生，促进免疫重建，提高单倍型造血干细胞移植的疗效。
    2.3 问题3：移植后复发白血病治疗结果 异基因造血干细胞移植后复发，目前尚无很有效解决方法。然而对于移植前疾病状态较差的患者，复发是移植失败主要因素，纪树荃与陈惠仁报告128例人类主要组织相容性抗原2个位点以上不同的半相合移植，3年存活率53%。而移植在疾病进展和复发期，2年存活率在30%左右，多数是复发死亡。单倍型移植存在更强移植物抗白血病作用，对于异基因造血干细胞移植后白血病复发，可以选择单倍型二次移植，仍然有较好的治疗，我们对1例无关移植后复发，接受二次单倍型（父亲）移植，病例1，男，5岁，急性髓细胞白血病，无关移植后1年复发，于2007年1月接受二次单倍型（父亲）移植，移植后3个月给供者淋巴细胞输注治疗，现移植后8个月，分子生物学鉴定完全供者造血，血常规正常，仍持续缓解。病例2 ，男，25岁，急性白血病，于2007年3月母亲供髓移植后原发排斥，在第一次移植后28天分子生物学证明原发植入排斥，于2007年4月接受父亲单倍型造血干细胞二次移植，11天植入，现移植后5月，血常规正常，分子生物学鉴定完全供者造血，仍然持续缓解。由于技术复杂，特别耐受、移植物抗宿主反应和排斥，单倍型二次移植的尝试需要深入研究。人类主要组织相容性抗原不全相合单倍型二次移植的成功为移植后白血病复发的治疗建立了初步方法。
    挖掘单倍型移植后过继细胞免疫治疗，用供者淋巴细胞输注作为一种过继免疫疗法用于异基因造血干细胞移植后白血病和骨髓瘤的复发治疗，供者淋巴细胞输注治疗异基因造血干细胞移植后复发患者移植物抗宿主反应发生率60%，而供者淋巴细胞输注在早期预防移植后白血病复发，移植物抗宿主反应发生率更高。Kawano及Eyrichi等认为在半相合移植中，低剂量供者淋巴细胞输注并改善不了受者免疫功能而常并发重症移植物抗宿主反应。也有持相反的报告，Lewalle在成人半相合移植中，12例难治高恶血液病，去除T和B淋巴细胞，接受小剂量供者淋巴细胞输注（1~3）×10*4/kg输注，最终6例复发，Ⅱ-Ⅲ急性移植物抗宿主反应发生2例。Tiberghien用单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶把丙氯鸟甘磷酸化，阻止DNA延伸，导致细胞死亡，预防供者淋巴细胞输注引起移植物抗宿主反应，使丙氯鸟甘杀死转染细胞。在供者淋巴细胞输注治疗中，不在使用免疫抑制剂预防移植物抗宿主反应发生，它减弱移植物抗白血病作用。
 依据作者和陆道培教授的报告，结果明显优于国外报告，显著的疗效与国内未进行T细胞清除相关，国内基本采用体外不去T的移植方式。