Omi/HtrA2基因与神经变性疾病的研究进展

作者：赵西耀 陈煜森    作者单位：广东医学院附属医院神经内科，广东 湛江 524001

【摘要】  人HtrA2（也称作Omi）是HtrA丝氨酸蛋白酶家族的新成员，可以通过破坏X染色体连锁的凋亡蛋白抑制物和caspase的相互作用，和（或）直接利用其蛋白酶活性诱导凋亡，也可以校正、降解错误折叠的蛋白质，抵抗应激，具有细胞保护的作用。研究已经发现它参与了许多疾病的发生、发展。作者就其生物学功能、单核苷酸多态性与神经变性疾病的相关性做一综述。

【关键词】  Omi/HtrA2 线粒体丝氨酸蛋白酶 基因多态性 神经变性疾病

  人HtrA2(也称作Omi)是HtrA丝氨酸蛋白酶家族的一个新成员，与大肠杆菌HrtA基因有广泛的同源。Omi/HtrA2是新近发现的一种致凋亡分子，许多其他大分子可以通过它诱导细胞凋亡；它也具有细胞保护作用，参与了许多疾病的发生、发展。作者就其生物学功能、单核苷酸多态性与神经变性疾病的相关性做一综述。

　　1  Omi/HtrA2的生物学特点

　　1.1  Omi/HtrA2的分子大小和结构

　　Omi/HtrA2基因位于人类染色体2p13.1，转录生成2.1 kb和4.5 kb 2种不同的mRNA，但以前者为主。它含8个外显子，全长Omi/ HtrA2蛋白含有458个氨基酸，大部分的正常组织器官中都有表达。在人类细胞系中，可以观察到相对分子量38 000和相对分子量40 000 2种多肽。

    正常情况下，成熟Omi/HtrA2与另外一种蛋白质Smac/DIABLO共存于线粒体内、外膜之间的膜间隙中，是一种线粒体蛋白质［1］。有3个主要结构：氨基末端的Reaper样基序［AlaValProSer(AVPS)］，可以与X染色体连锁凋亡抑制蛋白(Xlinked Inhibitor of Apoptosis Protein，XIAP)结合，发挥其促凋亡作用；中心的丝氨酸蛋白酶功能区（第166～342位氨基酸）；C末端的PDZ结构域(第364～445位氨基酸)，这一区域拥有独特的结合特异性，对Omi/HtrA2作用底物的选择起到重要作用［2］。除以上3个主要功能区以外，Omi/HtrA2前60位氨基酸序列（N末端）中含有线粒体定向序列，具有引导Omi/HtrA2进入线粒体的作用。在105～123位氨基酸残基之间可能还存在1个跨膜区。

　　1.2  Omi/HtrA2的生物学作用

　　1.2.1  Omi/HtrA2的致凋亡作用

　　完整的Omi/HtrA2分子在内质网合成后，由线粒体定向序列引导转运进入线粒体，通过此处的加工，形成成熟Omi分子，并储存在线粒体膜间隙中。当细胞受到刺激发生应激反应时，线粒体膜通透性增加，Omi/HtrA2分子从线粒体释放并进入细胞质和(或)细胞核中。在胞质中，它通过N端4残基IAP结合要区，即AVPS结合凋亡蛋白抑制物（inhibitor of apoptosis protein,IAP）的杆状病毒IAP重复结构域（baculovirus IAP repeats,BIRs），通过破坏caspaseIAP复合物，和/或诱导IAPs的自动泛素化和降解，促进了caspase3、7、9活性，因而解除了IAPs对caspases的阻止，诱发了凋亡。同时还可借自身的酶活性切割、降解IAPs［3］。另外，IAPs也可以下调Omi/HtrA2的水平。Omi/HtrA2与凋亡拮抗分子ped/pea15的相互作用也与此类似［4］。

    此外，Hedge等［1］利用MCF7细胞，发现caspase被XIAP阻止后，Omi/HtrA2仍可以诱导细胞死亡，细胞质中缺乏AVPS基序的Omi/HtrA2变异体也引起了细胞死亡。这都证明Omi/HtrA2具有caspase非依赖的致凋亡作用。此作用机制，目前研究较少。

    已经发现许多物质可以增强Omi/HtrA2的水解酶活性,促进细胞死亡：p53蛋白［5］、S100 A8 /A9、超氧化物歧化酶1、WARTS蛋白激酶，即大肿瘤抑制物1有丝分裂激酶［WARTS (WTS)/large tumorsuppressor 1 mitotic kinase,WTS］、Fas、早老素1（presenilin1,PS1)蛋白、PINK1等［6］。同时，一些分子可以通过阻止Omi/HtrA2的水解酶活性，阻止凋亡。线粒体中Bcl2过多表达、Akt激酶、癌基因ras、人类乳头状病毒E6、人类乳头状病毒8编码的癌蛋白、病毒干扰素调节因子1（viral IFN regulatory factor 1，vIRF1）［7］等都具有阻止Omi/HtrA2的水解作用，而发挥抑制凋亡的作用。

 过度表达Omi/HtrA2将导致线粒体膜功能障碍，将促进caspase介导的和caspase独立的细胞死亡。也有报道称，Omi/HtrA2的神经元特异性过多表达的鼠，既不影响正常的神经发展，也不影响其他的表型，如行为。这些鼠具有正常的体质量、毛发、活动性、行为、器官质量和繁育能力［8］。

　　1.2.2  Omi/HtrA2的细胞保护作用

　　Omi/HtrA2是一类较为特殊的蛋白质，它既具有蛋白酶活性，同时还是分子伴侣。随着外界环境温度的升高，它将通过PDZ结构域重新定位，由分子伴侣转变成为蛋白酶功能。当温度较低时，Omi/HtrA2更容易使错误折叠的蛋白重新正确折叠。而在温度较高的情况下，错误折叠蛋白损伤过于严重，Omi/HtrA2只有利用蛋白酶活性将其裂解，才能有效地将其移除以维持细胞正常功能。正常情况下，Omi/HtrA2感受应激刺激，阻止错误折叠和破坏的蛋白质的积累，保持线粒体膜完整和具有功能。

    通过神经元特异性Omi/HtrA2过表达的转基因鼠的研究发现：Omi/HtrA2在神经元内的主要角色可能是对抗应激的神经保护作用。Omi/HtrA2纯合子基因敲除的鼠，将会因为纹状体神经元丧失，导致早期的死亡。对此鼠的提取物进行分析显示，此种动物线粒体柠檬酸合酶的合成也会下降，从而提示线粒体密度的下降［8］。用透射电镜的方法研究发现，当遭受细胞应激刺激物如复合物I阻止子毒鱼藤素和线粒体膜电位解耦连剂碳酰氰基对氯苯腙时，Omi/HtrA2丧失细胞线粒体形状的明显改变，而在对照组中没发现这种改变。从而证实此种细胞对应激敏感性增加［9］。这些都证明了Omi/HtrA2的细胞保护作用。

　　1.2.3  Omi/HtrA2与细胞周期的相关性

　　Kuninaka等［10］发现WTS与Omi/HtrA2的PDZ区域相互作用，WTS既是其底物，也能促进其蛋白酶活性。当用十字孢碱处理caspase9缺陷鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，MEFs)时，激活的Omi将水解WTS，但未引起细胞死亡。从HeLa细胞内删除Omi蛋白，有丝分裂的持续时间没有明显改变，但细胞繁殖将会加速，删除WTS对细胞分裂的S期具有同样效果。因此推测Omi水解WTS产生的片段可能在G1/S期阻止细胞分裂，从而证明其参与控制细胞增殖。

　　2  Omi/HtrA2的多态性

    目前对其多态性研究集中于其外显子区。成熟的Omi/HtrA2位置4的丙氨酸变为异亮氨酸时，XIAP对BIR的亲和力将增加。成熟Omi/HtrA2的氨基端在与XIAP相互作用时起重要作用的丙氨酸和具有蛋白酶活性的丝氨酸残基，二者任意1个发生突变都能减弱Omi/HtrA2促进凋亡的能力。而在二者都突变时，其促凋亡作用将丧失。PDZ功能区对二者均有调节作用。Yang等［11］研究发现Omi/HtrA2的212位丝氨酸突变为丙氨酸时，Akt无法对其磷酸化，Omi/HtrA2将保留丝氨酸蛋白酶活性，诱导更多的凋亡。当发生HtrA2/OmiS212D突变时，突变的拟态磷酸化，将因失去其蛋白酶活性而不能诱导凋亡。

    Strauss等［12］通过DNA变性，对PCR片段进行高效液相色谱层析、直接测序、细胞荧光分析等方法，在Omi/HtrA2的氮端和PDZ区分别发现了G421T（A141S）和G1195A（G399S）突变。二者分别位于外显子1和7。此2种突变的Omi/HtrA2与野生型的具有相似的亚细胞分布，不影响加工成为成熟的Omi/HtrA2。虽然其编码蛋白质不相同，但这2种突变都可以导致Omi/HtrA2蛋白酶活性的缺失。通过对表达过多的此2种突变的Omi/HtrA2的细胞进行分析，与野生型细胞相比,发现后二者更易引起线粒体膜电位的降低，及形态学的改变和肿胀，线粒体功能障碍，因此调节了细胞死亡。并发现表达S399突变的Omi/HtrA2的细胞对于应激诱导的死亡更为敏感。基于6个毗邻的单核苷酸多态性的分析，在拥有Omi/HtrA2基因染色体的功能区中，11个标记的基因型显示，G399S突变的携带者都具有同样的单倍型。他们在外显子1中还发现了不导致氨基酸改变的C447T突变。

Bogaerts等［13］通过突变分析的方法验证了Omi/HtrA2的PDZ区域的1个新的突变位点Arg404Trp，该位点的突变将预测Omi/HtrA2失活。通过荧光素酶报告基因分析的数据，在可能影响Omi/HtrA2表达的5′和3′区域，验证了六个患者特异性突变体，并推测此突变可能影响了其转录活性。

    目前发现的多态性位点还有S276C，此位点的突变可以导致帕金森病表型。S306A的突变，导致Omi/HtrA2活性的丧失。

　　3  Omi/HtrA2与神经变性疾病的相关性

　　3.1  Omi/HtrA2与阿尔茨海默病

　　Omi/HtrA2参与阿尔茨海默病可以通过以下4种形式：（1）通过酵母双杂交和亚细胞分级等方法，发现Omi/HtrA2可以结合淀粉样前蛋白(amyloid precursor protein，APP)的氮末端半胱氨酸富集区，直接促进细胞内与该酶接合的APP的降解。Park等［14］发现切割位点是APP的306到588位氨基酸区域内，其产物是APP695，包含535～695位氨基酸的C161片段;（2）通过酵母双杂交和免疫共沉淀的方法发现，Omi/HtrA2可以通过其PDZ区域接合到分泌酶复合物的关键成分，β淀粉状蛋白(amyloid beta,Aβ)、PS1和PS2的羧基端，影响该酶的水解作用，从而阻止了APP和Aβ的产生［14］;（3）PS1的羧基末端可以结合到Omi/HtrA2的PDZ功能区，显著增加Omi/HtrA2的蛋白酶活性，促进凋亡的发生［15］;（4）Park等［16］运用酵母双杂交和免疫共沉淀的方法发现Omi/HtrA2还可以直接水解Aβ。

　　3.2  Omi/HtrA2与帕金森病

　　Karsten等［12］对414例帕金森患者和331例健康人用G421T多态性做1个相关性研究，发现病例组中有26个杂合子个体（6.2%），对照组中只有10个（3%），并验证了A141S基因多态性与PD呈显著性相关(P<0.05)，同时没有发现突变的纯合子携带者。相比之下，在4个散发性的PD患者中得到确认的G1195A的替代，在健康对照的740条同源染色体中却没有发现。他们还在原发性PD患者大脑Lewy小体(PD的特征性病理改变)中检测到了Omi/HtrA2分子，同时观察到编码Omi/HtrA2的基因发生突变时，引起了与PD特征相同的神经变性。

    Martins等［17］发现Omi/HtrA2敲除动物的分析表明，从出生后18 d起，与野生型和杂合型相比，它们显示了明显的表型改变。最明显的改变有：出生18 d，断奶后体质量不增，体材瘦小。还有总体上器官体积减小，以胸腺，心脏和脾特别明显，偶尔有毛发的缺损。该鼠还存在线粒体功能障碍，纹状体中神经元数量的选择性丧失，帕金森表型的神经衰退疾病，并由此导致在出生30 d左右死亡。黑质纹状体通路的突触前和突触后缺陷，纹状体前面区域，有神经元的丧失和Th阳性纤维的降低，这和一些帕金森综合症具有相似性。

    运动神经元退变2(motor neuron degeneration 2,mnd2)鼠具有帕金森样表型，比如肌强直和震颤，纹状体神经元丧失导致的早期死亡。这可以由一种位于Omi/HtrA2蛋白酶活性区域Ser276Cys的错义突变引起的。它使Omi/HtrA2的蛋白酶活性极大地降低，却不影响Omi/HtrA2的定位及与IAPs的结合能力。Jones等［18］的研究显示此突变可引起线粒体功能障碍。靶向性的Prss2基因纯合子缺失导致的Omi/HtrA2无表达鼠研究证明，这些动物的外表是和mnd2鼠是同类的。Omi/HtrA2突变的帕金森患者也具有类似现象。
   
　　人类HtrA2的PARK13位点的点突变者易遭受帕金森病。在对早发型帕金森病易感性方面，线粒体蛋白激酶PINK1的突变和常染色体隐性遗传位点PARK6是伴随的。HtrA2在p38激活通路中磷酸化，这是以PINK1依赖的方式，在帕金森患者中突变的1个位点附近的1个残基上发生的。在PINK1突变的帕金森病的患者脑中，HtrA2磷酸化降低。从而推测PINK1依赖的HtrA2的磷酸化可能调节了它的蛋白水解活性，因此促进了细胞对线粒体应激抵抗性的增加［19］。Bogaerts等［13］通过HtrA2功能性PDZ区域的突变，进一步证实了其在帕金森易感性方面的作用。

　3.3  Omi/HtrA2与亨延顿舞蹈病

　　亨廷顿舞蹈病的发病机制涉及了突变亨廷顿基因导致的毒性，和野生型等位基因潜在降低的保护作用。分子结构方面的异常包括该病细胞中聚集体的出现，转录失调，改变的线粒体膜电位，异常的Ca2+调控，和暴露于毒性刺激物时，该病细胞和组织增加的细胞色素C的释放，caspase9和caspase3的激活。Goffredo等［20］发现导致亨延顿舞蹈病的一个重要原因就是脑细胞中Omi/HtrA2释放紊乱引起胞浆中IAP1和XIAP含量降低。利用HTRA2的特异性抑制剂ucf101能够抵抗亨延顿细胞中IAPs的降解，增加细胞的存活，延缓疾病的进程，并指出IAPs可以成为该病潜在的药物靶点。

　　4  展望

    Omi/HtrA2是哺乳动物体内一种重要的线粒体丝氨酸蛋白酶，在蛋白质修复和细胞凋亡中有重要作用，迄今为止相关分子机制尚不完全清楚，特别是在生理、病理过程中的调控机制还未深入涉及，但是随着研究步伐的加快，对Omi/HtrA2的认识也将更为全面。另外，随着特异性阻断剂的出现和应用，下一步应该加大对Omi/HtrA2与相关疾病关系的研究力度，这将为临床针对特定靶点治疗有关疾病提供一定依据。

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