胆汁反流与食管黏膜上皮损伤的研究进展

作者：龚均，张茹    作者单位：西安交通大学医学院第二附属医院消化内科，陕西西安 710004

【摘要】  尽管十二指肠胃食管反流的研究已有100多年历史，但不明点仍很多。本文复习文献并结合我们的研究成果，就胆汁对食管黏膜的损伤，包括损伤的可能机制、食管内胆汁反流的诊断、治疗等方面作以介绍，重点对胆汁在Barrett食管和食管腺癌发生中的作用及其防治作了阐述

【关键词】  十二指肠胃食管反流；胆盐；食管；上皮细胞；治疗

基金项目：卫生部临床学科重点资助项目(No.20012130)
　　Bile reflux and its injury on esophageal mucosal epithelial cells

　　Gong Jun, Zhang Ru

　　Digestive Department of the Second Affiliated Hospital,Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710004, China

　　ABSTRACT: There are also many unanswered questions on the duodenogastroesophageal reflux(DGER), though it has been studied for more than 100 years. Based on the references and our studies, we reviewed the bile injury on esophageal mucosal epithelial cells, the diagnosis and treatment of bile reflux into esophagus. The relationships of the biles with Barretts esophagus and esophageal adenocarcinoma were elucidated especially.

　　KEY WORDS: duodenogastroesophageal reflux; bile salts; esophagus; epithelial cell; therapy

　　十二指肠胃反流(duodenogastric reflux, DGR)是指十二指肠内容物包括胆汁、胰液和肠液通过幽门反流至胃内的一种病理生理现象。DGR及其相关疾病的研究虽然已有100多年的历史，但至今仍有许多问题尚未明确。随着检测手段的进步，DGR逐渐受到重视，特别是胆汁反流在食管黏膜损伤中的作用，如反流性食管炎既往一直认为是胃酸(胃蛋白酶)反流至食管引起的损伤所致，检测方法为测定食管下段pH值，如pH＜4称存在酸性反流[1]。但是，近年来研究表明，胃反流到食管内的内容物往往混有十二指肠液(其中含有胆汁)，如国内外报告超过半数以上的患者用相关仪器检测到食管内的酸性反流物中含有胆汁[23]，此种反流也称十二指肠胃食管反流(duodenogastroesophageal，DGER)。现就有关问题结合文献和我们所做的工作综述如下。

　 1  DGER的病因和发生机制

    DGR是DGER的基础，文献报道DGR可发生于生理状态，也见于病理状态。生理性DGR的发生与胃十二指肠消化间期运动移行综合波(MMC)有关,多见于MMCⅡ相末期，此期十二指肠内胰液和胆汁分泌量显著增加，为反流提供了物质基础；Ⅱ相无规律的运动产生了反流所必须的压力梯度[45]。此外也与MMCⅢ相逆蠕动有关，MMCⅢ相具有强力的推动作用,可起抗反流作用,而逆蠕动则起相反作用[67]。我们的研究也得到类似结果[8]。病理性DGR则与胃十二指肠动力异常[9]、胆囊功能障碍[10]、完整的解剖结构被破坏[11]、幽门括约肌功能障碍[12]以及胃肠激素异常[13]等因素有关。但我们研究胆囊切除术后患者的DGR结果表明，与正常对照比较DGR并不增加，可能与检测方法不同有关，以往多用胃镜和胃管抽吸胃内物研究DGR发生情况，我们通过Bilitec 2000监测胆汁反流其敏感性、特异性更高[14]，与Manifold用同样方法监测的结果一致[15]。我们另一项胃肠激素与十二指肠反流及消化间期胃肠移行性复合运动的关系研究显示，胃动素、P物质、生长抑素水平与DGR的发生无关，而一氧化氮浓度改变可能与DGR有关[16]。

    在DGR的基础上发生胃食管反流(gastroesophageal reflux, GER)，因其反流物中不但含有胃酸(胃蛋白酶)，也含有十二指肠内容物(包括胆汁)，故称其为DGER。发生GER的原因有下食管括约肌压力降低，特别是发生一过性松弛(transient lower esophageal sphincter relaxation, TLESR)、腹内压的上升引起跨膈压差增大、食管体部清除功能降低、胃排空减慢等。反流物对食管黏膜的损伤还与食管上皮的屏障功能有关[17]。

    2  胆汁对食管黏膜的损伤作用

    胆汁对食管黏膜的损伤日渐被学者所认识，认为在胃食管反流病(gastroesophagel reflux diseases, GERD)如反流性食管炎(RE)、Barretts食管(BE)及其并发食管腺癌的发生发展过程中起重要作用[2]，尤其与BE和食管腺癌的发生密切相关[18]。

    胆酸引起食管黏膜损伤的机制有两种假设。其一是与胆酸的膜表面去污性相关。胆酸可以溶解细胞脂类膜，引起细胞膜破坏，导致细胞损伤。另一机理是由于具有亲脂性，所以胆酸能够进入细胞内，使细胞内胆酸浓度过高，破坏了细胞内膜系统，而致细胞坏死[19]。但是，如上学说仅仅处于推断阶段，并未通过食管上皮细胞或者同类实验得到验证。

    通过给动物食管内灌注不同胆酸以及胆盐和胃液混合液的方法发现，不同胆酸对食管的损伤作用与pH值密切相关，结合胆酸在pH 2和非结合胆酸在pH 7时会引起食管黏膜的损伤。这主要可能是与胆酸的溶解和胆酸进入细胞内的量相关。可溶性胆酸以非离子形式存在时可进入细胞内离子化而被捕获。结合胆酸的pKa是1.9，在pH 2-5时以非离子形式为主，而非结合胆酸在pH中性时以非离子形式结合为主，非离子形式的胆酸更具有亲脂性，更容易通过食管黏膜屏障进入细胞[19]。因此，结合胆酸在酸性环境下(pH 2)和非结合胆酸在中性环境下(pH 5-7)时会更容易引起食管黏膜的损伤。

    为了进一步明了胆汁对食管黏膜的损伤，我们做了以下实验。

　　2.1  胆汁对正常人食管黏膜上皮细胞影响的体外实验

　　以往研究胆汁对细胞的损伤作用主要集中在对肝细胞、肠细胞的损伤，对食管上皮的损伤只是对食管癌上皮细胞的作用[19]，随着细胞培养技术的提高，胆汁对正常食管黏膜上皮的作用已成为可能[2021]。本组采用无血清的角朊细胞培养基培养正常人食管黏膜上皮细胞，观察胆汁中的不同成份，包括6种胆盐(甘氨酸胆盐、甘氨酸鹅脱氧胆盐、甘氨酸脱氧胆盐、牛磺酸胆盐、牛磺酸鹅脱氧胆盐、牛磺酸脱氧胆盐)和2种胆酸(胆酸、脱氧胆酸)及6种胆盐的混合物对人食管黏膜上皮细胞分化及凋亡的影响。结果：在较高浓度(250-1000μmol/L)下，除甘氨酸胆盐外，其他5种胆盐、2种胆酸及6种胆盐混合物均可抑制食管上皮细胞生长，且呈浓度时间相关性变化。胆盐(除甘氨酸胆盐外)和胆酸还可诱导正常食管上皮细胞凋亡。例如500μmol/L牛磺酸胆盐、500μmol/L脱氧胆酸作用24h凋亡细胞达83.5%、87.5%，而对照组为1.5%，引起细胞凋亡可能与线粒体凋亡调节途径密切相关[2223]。但在低浓度(20-50μmol/L)时，除甘氨酸胆盐外，其余胆盐及胆盐混合物均能促进正常食管黏膜上皮细胞分化，Ca2+ 可能参与了诱导细胞分化的胞内信号途径[24]。所以，我们推测反流性食管炎不同的病理学改变可能与反流物中所含胆盐浓度不同及作用时间不同有关。

　　2.2  不同反流物对食管黏膜损伤的在体实验

　　应用不同手术方式对SD大鼠建立单纯胃液酸性反流、单纯十二指肠液反流和胃酸十二指肠液混合反流模型是国内外学者常用的方法，由于手术方式不同，各种反流物的反流量不同。因此，得出何种反流对食管黏膜损伤大的结论也不同。例如，有的认为混合反流比单纯胃液反流或单纯十二指肠液反流的损害大[25]，有的认为单纯十二指肠液反流的损伤比混合反流或单纯胃液反流的损伤大[26]。胆汁作为十二指肠反流物的重要反流物质，目前研究表明其损伤作用是Barretts食管和食管腺癌发生的重要因素，国内尚未见有单独观察胆汁对食管黏膜损伤作用的实验报告，为此我们设计了一种手术方式，即造成混合反流的手术式，在此基础上，使用质子泵抑制剂抑制胃酸分泌，使SD大鼠胃内pH上升达4以上，使胃蛋白酶失活，达到无酸性反流的十二指肠液反流(不像文献切除胃将食管与十二指肠直接吻合造成无胃液的反流)。又在混合反流的模型基础上结扎SD大鼠胆管，造成无胆汁的混合反流。这样在同一模型的基础上制造成三种不同反流模型，此时反流物内容不同而反流量大致相同，具有一定的可比性。实验结果为混合反流损伤最大，其次为无胃酸的十二指肠液反流，无胆汁的混合反流损害最小。对实验SD大鼠食管黏膜病理学检查发现无胆汁的混合反流所致食管黏膜损伤中未见Barrett上皮出现，而无胃酸的十二指肠液反流或含有胆汁的混合反流均有 Barrett上皮出现。推测Barrett上皮可能与胆汁损伤食管黏膜上皮细胞有关[27]。

    3  胆汁反流的诊断

    早在100多年前，在胃切除手术时，就发现了十二指肠胃反流的问题，但是苦于一直没有实用的临床检测方法，对于胆汁反流的研究一直进展不大。随着近年来多种检测方法的出现，研究者对胆汁反流的认识才略显明了。在众多的反流检测方法中，早期通常是侵入性的方法，例如通过插入胃管抽吸食管液，检测其中的胆汁酸浓度[28]，但其有较多的假阳性。放射性核素检测法被认为是无创、敏感性较高的诊断GER的方法，但其不能区分反流物内容[29]。由于胆汁反流具有间断性发生和无规律性的特点，短时间检测结果常不可靠，因而24h pH监测[30]、24h胆红素监测[31]逐渐被用于临床。早先认为食管pH监测如pH＜4为存在酸性反流[32]，但有报道同步监测胃内pH值和胆红素吸光值显示胃内胆红素升高而pH值不升高，或pH值升高而胆红素不升高的现象[33]，说明胆汁反流不一定影响pH值变化。我们所做体外实验显示在一定浓度下，胆汁对胃液的pH值影响很小[34]。通过光纤技术测定胆汁中的成分——胆红素，被认为是最直接反映胆汁反流的方法，其原理为测定样品在一定波长光照下的吸光值来确定样品中某种物质的浓度，胆红素在450nm处存在特异的吸收高峰，在该波长光照下，不同的吸光值对应了不同的胆红素浓度。但其前提是必须严格控制饮食，因摄入食物其吸光值如接近450nm，则可造成假阳性[35]。我们的研究表明有色的食物、饮料、调味品对吸光值多少都有影响，而无色(或白色)的食物、饮料、调味品对吸光值无影响，此点在判断结果时需注意[36]。近年来还有用测定食管腔内阻抗变化来判断有无反流，无论是胃液、十二指肠液反流，甚至嗳气都可造成食管腔内阻抗变化[37]。但该方法也无法区分酸性反流和非酸性反流。

　 4  胆汁反流的治疗

    从SD大鼠混合反流模型可观察到从炎症→Barrett食管→腺癌的过程[38]。目前，临床治疗胃食管反流主要从抑制胃酸、中和胆汁、促进排空、黏膜保护剂等方面入手[3940]。我们对大鼠混合反流模型采用以下药物治疗：一组用质子泵抑制剂灌胃，使SD大鼠胃内pH值保持在4以上，连续观察8周，结果可见灌药组食管黏膜炎症明显比未灌药组减轻，但Barrett上皮的发生率二组无差别[27]。另三组分别用中和胆盐的铝碳酸镁、胃肠动力药西沙比利和环氧合酶抑制剂萘丁美酮灌胃，观察这些药物对混合反流SD大鼠食管黏膜的保护作用。结果表明这些药物都有一定的保护作用，尤以铝碳酸镁、萘丁美酮组Barrett上皮的发生率明显低于对照组，观察40周时对照组有2例腺癌发生，而这两种药灌注组无腺癌发生[41]。

    从上述实验可见，胆汁对食管上皮有损伤作用，十二指肠液与胃液混合反流对食管上皮的损伤比单纯十二指肠液反流所致损伤更大。但Barrett上皮的发生可能与胆汁反流有关。目前，临床治疗反流性食管炎国内外均推荐用质子泵抑制剂。该类药物虽能减少胃液分泌，减低胃液酸度从而使胃蛋白酶活性减低，可使酸性反流或混合反流所致的食管炎症减轻，但并不能防止Barrett上皮的发生。我们观察SD大鼠从正常食管黏膜→食管炎→Barrett上皮→腺癌的过程中，环氧合酶2、增殖细胞核抗原、细胞周期蛋白D1的表达程度和阳性表达率逐惭增强，使用环氧合酶抑制剂萘丁美酮干预治疗后上述三项指标的表达程度和阳性表达率均较对照组明显降低，炎症程度亦减轻并延缓病程进展，能降低Barrett上皮和重度不典型增生的发生率，从而有可能抑制腺癌的发生[42]。文献也有报告，SD大鼠造成Barrett食管后使用环氧合酶2抑制剂可使不典型增生和食管腺癌的发生率低于对照组[43]。由于临床上胃食反流病的患者中混合反流占大多数，如何针对胆汁对食管黏膜长期剌激引起的损伤，特别是对引起Barrett上皮→腺癌的危险性进行治疗，值得我们重视，环氧合酶抑制剂的应用也值得进一步深入研究。

    5  展望

    自80年代Losec(奥美拉唑)问世以来，新的质子泵抑制剂不断诞生，抑酸效果越来越好，极大改善了反流性食管炎的病情[4445]。但据西方国家文献报告食管腺癌呈逐年上升趋势，与食管鳞癌构成比大致相等甚或有超过倾向[46]，有人认为可能与使用质子泵抑制剂有关[47]。尽管肿瘤的发生涉及多种因素，但是Barrett上皮与食管腺癌的关系得到肯定[48]。因此，能否从其他途径如胆汁的作用及其对策来深入研究以防止Barrett上皮和食管腺癌的发生，是临床研究值得关注的问题。

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