组织工程化软骨的构建及应用

作者：曹峻岭，付强   
作者单位：西安交通大学医学院公共卫生系地方病研究所，教育部环境与疾病相关基因重点实验室，卫生部微量元素与地方病重点实验室，陕西西安 710061

【摘要】  “组织工程”(tissue engineering)是上世纪80年代正式提出来的新概念。它是生物医学和材料科学多学科交叉融合的新兴分支学科。近20年来，该学科有了很大的发展，其研究范围也更加广泛。本文结合我们近年的研究成果，着重论述组织工程化软骨的构建及其在软骨损伤和修复研究中的应用。

【关键词】  组织工程；软骨种子细胞；骨基质明胶；细胞生长因子；软骨损伤；软骨修复

基金项目：国家自然科学基金资助项目(No.30471499，30170831)；教育部科学技术研究重点资助项目(No.03152)；陕西省国际科技合作重点项目(No.2004KW-20)

　　Fabrication and application of tissue engineered cartilage

　　Cao Junling, Fu Qiang

　　［Institute of Endemic Diseases, Key Laboratory of Environment and Genes Related to
Diseases of Ministry of Education, Key Laboratory of Microelement and Endemic Disease of
Ministry of Health, Medical School of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, China］
ABSTRACT: Tissue engineering, a concept proposed at the end of the 80s of last century, is a newly rising subdiscipline that intergrates several subjects such as biomedicine and material science. A great development appeared in the last two decades, and the research scope was getting more extensive. In this article, we will expound the fabrication of tissue engineered cartilage and its application in the cartilage injury and repairing by referring to the results of our research.

　　KEY WORDS: tissue engineering; cartilage seed cell; bone matrix gelatin (BMG); cell growth factor; cartilage injury; cartilage repair

　　1  引言

　　骨关节炎(osteoarthritis, OA)、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)以及主要分布在我国的大骨节病(Kashin-Beck disease，KBD)一直是困扰人类健康的骨关节疾病。在美国将近有三千六百万人患有各种类型的骨关节疾病，在中国虽没有确切的普查资料，但因人口基数较大以及老龄人口的增加，影响面也十分广泛。骨关节病是关节软骨由于外伤和退行性变等原因出现损伤，从而导致关节长期的疼痛和功能障碍，甚至关节废用，而关节软骨无血液供应和神经支配，并且软骨细胞的低代谢活性和高密度的细胞外基质(extracellular matrix, ECM)限制了软骨细胞向缺损区域移行并修复［1-2］。因此，关节软骨在损伤后几乎不能自发修复。在某些情况下虽可发生自发性修复反应，但新生的组织主要以纤维软骨组织为主，与正常透明软骨的组织结构和化学成分有很大的不同，并且在生理负荷下会很快发生退行性变，最终发展成骨性关节炎。为此，关节软骨缺损的修复一直是骨科研究的热点问题。传统的治疗方法如微骨裂(microfracture)，软骨下钻孔(subchondral drilling)，骨膜、软骨膜移植(periosteum and perichondrium grafts)等已经被广泛地应用于关节软骨的损伤修复。但是，研究结果显示，这些修复方法只能暂时的缓解疼痛等症状，其修复部位主要由纤维软骨填充而不是透明软骨，其最终结局还是修复部位软骨的退化坏死［3-5］。

　　组织工程是生物医学和材料科学交叉融合的产物。它应用生命科学和工程学的原理及方法构建工程化组织，通过认识哺乳动物正常和病理组织的结构功能关系，研究开发生物代用品，从而达到修复、维持或改善人体组织、器官形态和功能的目的。随着组织工程学的进展，组织工程化软骨的构建不仅为关节软骨缺损修复开辟了一条新的途径，而且为建立和研究OA、RA和KBD等骨关节病组织模型奠定了基础。本文将结合本课题组近年来的研究成果，重点论述组织工程化软骨的构建及其应用。

　　2  组织工程化软骨的构建

　　软骨组织工程主要是在体外培养、扩增软骨种子细胞，并以较高密度将其种植于具有良好生物相容性和降解性的支架材料上，在多种调节因素的作用下经过一定周期形成组织工程化软骨。组织工程软骨的构建需要具备三个主要条件：足够数量、功能正常的种子细胞；合适的细胞支架；调节细胞增殖、保持细胞表型特征的细胞因子，也可以说是合适的体外培养条件。以下将围绕本课题组使用的同种异体软骨细胞/自体骨髓基质干细胞复合骨基质凝胶(bone matrix gelatin, BMG)简述组织工程化软骨的构建。

　　2.1  种子细胞

　　种子细胞的选择是组织工程化软骨的重点内容, 理想的软骨组织工程种子细胞应该具备以下几个特点：①易取材，且对机体损伤小；②具有较强的增殖能力，且易分化为目标细胞；③对于相应的支架材料，黏附能力强；④能够耐受环境的变迁，适应不同应力条件。我们的研究工作主要涉及同种异体软骨细胞、胚胎源性细胞和间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)等种子细胞。

　　2.1.1  成熟软骨细胞

　　自体软骨细胞是目前最好的软骨组织工程细胞来源，其最大的优点就是可以避免免疫排斥反应，但自体软骨细胞的来源有限且属于损伤取材，并需要进行二次手术，在体外单层培养时增殖能力较低，经过传代培养易发生去分化。其ECM中蛋白聚糖表达较弱，胶原表型表达易由Ⅱ型转向Ⅰ型和Ⅲ型，加之在实际操作中难以从少量组织经体外培养扩增出大量有正常功能的软骨细胞，从而限制了它的应用。

　　同种异体软骨细胞来源相对广泛。应用同种异体软骨细胞作为种子细胞已在具有免疫力的动物体内成功获得了同种异体的组织工程化软骨，而且并未发现明显的免疫排斥反应［6］。大量研究结果已经证明，同种异体软骨细胞可在受体内长期生长并保持分泌基质的功能［7］。与自体软骨细胞相比，具有来源广泛，取材容易，易于大量培养等优势，因而应用前景比较广阔。

　　2.1.2  胚胎源性细胞

　　胚胎软骨细胞的优点是免疫原性小，细胞生长活跃，增殖较快。既往研究表明，胚胎来源的软骨细胞比成年人的软骨细胞有更强的增殖能力且引起的排斥反应要微弱得多［8-9］。相关研究以其作为种子细胞用于修复关节软骨缺损获得了良好的效果，没有引起明显免疫排斥反应，修复组织也未见明显退变，可以认为它是构建异体软骨组织工程较好的种子细胞来源。另外，胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESCs)由于其独特的高度未分化特性和发育全能性，具有无限增殖并分化成机体200余种不同细胞的潜能。因而，近年来引起组织工程学家的极大关注，有望成为组织工程中种子细胞的新来源。国外相关研究已成功在体外使用BMP-2和BMP-4作为调控诱导因子使ESCs分化为软骨细胞［10］。但是，其来源及伴随的伦理学问题是限制其应用的最大障碍。

　　2.1.3  间充质干细胞(MSCs)

　　MSCs可来源于骨髓、骨膜、软骨膜、肌腱等多个部位，是目前公认的最具有应用前景的种子细胞。它可向骨、软骨、肌腱、脂肪等多种组织分化。在一定诱导条件下分化成的软骨细胞增殖能力强，且许多实验已证实MSCs分化的软骨细胞与正常软骨细胞形态相似，具备分泌软骨特异基质的能力。骨髓来源的间充质干细胞——骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BM-MSCs)取材方便，操作简单，并发症少。成人一次骨髓穿刺2-5 mL后，体外培养3代以上仍能保持多向分化潜能。作者等使用TGF-β1、IGF-1体外诱导兔自体BM-MSCs细胞增殖并向软骨分化，与同种异体BMG结合后在体外成功构建了组织工程化软骨［11］。其他相关研究应用胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor, IGF)诱导兔自体BM-MSCs细胞体外培养24 h后，再与无细胞基质共培养24 h后植入兔膝关节，术后24周形成成熟关节软骨，且形成的组织与周围正常关节软骨结合良好［12］。此外，脂肪干细胞［13］、肌源性干细胞［14］也具有成软骨作用。

　　近年来，MSCs是国内外研究的热门话题，其应用还处于探索阶段，像MSCs的分离纯化和定向分化尚不成熟，MSCs的增殖分化控制需要合适的条件，如何稳定地既控制增殖又能在适当的时候启动向所需的目的细胞分化也有待进一步的研究。

　　2.2  载体支架材料

　　细胞黏附、增殖和分化等功能的发挥依赖于ECM的存在。因此，对ECM替代物——支架材料的选择至关重要。理想的支架材料应该可以模仿关节软骨基质的微环境：①能对软骨细胞生长提供力学支持；②对细胞无毒害作用，有较好的生物相容性，不易引起炎性反应，并可以促进种子细胞黏附；③具有良好的生物活性，能够帮助维持软骨细胞的表型表达；④应该具备多孔疏松的三维结构以保存大量细胞，并且有利于营养物质和氧气的进入和细胞代谢产物的排出，从而有利于软骨细胞的新陈代谢；⑤具备很好的生物降解性，利于细胞增殖，并且要求支架材料的降解速率应与细胞的增殖速率相匹配［15-16］。现今有多种支架材料被用于软骨组织工程，按其来源不同大体可分为天然的和人工合成的两种［16-17］。人工合成的支架材料因其来源广泛、易加工成所需的形状等优势近年来得到了广泛的发展，相比于天然支架材料，它具有极好的生物力学性能，并且可以根据需要调整其理化特性和生物降解速率，但因其较弱的亲合性和一定程度的细胞毒性作用限制了它的应用［17］。而天然支架材料因其较好的亲合性而有利于细胞的黏附和增殖被视为细胞生长的天然载体［18］。它具有良好的生物可降解性，经过去抗原处理后生物相容性好，还含有生长因子类物质，可以进一步促进细胞的识别、黏附、增殖和保持分化特性。其缺点是力学性能较差，降解速度快、大量制备困难，不同批次质量差异波动较大，且因其来自于天然生物体，处理不当尚有传播疾病的危险。
   
　　到目前为止，还没有一种材料能够完全满足组织工程的要求。如何选用合适的支架材料作为软骨组织工程的载体，需根据所构建的组织工程化软骨的用途以及实际操作的可行性来决定。我们在软骨损伤机理研究和修复骨软骨缺损中主要使用BMG作为支架材料。BMG是天然骨组织经过去脂、脱钙和去蛋白处理后得到的海绵样基质，其主要成分为骨基质胶原。此外，在BMG中还保含有多种生长因子，包括胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor, IGF)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF)、转化生长因子(transforming growth factor, TGF)和骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)。这些生长因子对于促进种子细胞增殖和维持分化表型极其重要。既往研究提示：BMG能够在体外诱导MSCs分化为成软骨细胞［19-20］，并且能在体内的骨软骨缺损处形成透明软骨样软骨组织［21］。近年来BMG作为骨替代品被广泛地应用于骨损伤后的修复和重建 ［22-26］，但很少有报道用于软骨损伤修复。作者等通过实验证明：BMG无细胞毒性，移植后免疫排斥反应低并具有较强的诱导骨、软骨生长、分化的作用，具有很好的生物相容性和可降解性，并且克服了一般天然支架材料生物强度低的缺点，能够为种子细胞提供足够的机械支持［27］。此外，BMG还非常易于储存，在低温条件下可以维持其活性多年，而且因其保留有多种生长因子，所以使用起来成本较低，利于推广。作者等应用皮质骨BMG作为支架材料体外培养兔软骨细胞6周后，形成1.3 mm厚的新生透明软骨样组织，相关检测表明该新生组织中含有关节透明软骨表型的标志物——Ⅱ型胶原和蛋白聚糖。显微镜下观察新生组织虽具有层次性，但与正常透明软骨基质及细胞分层仍存在着明显的不同［28］。这可能是由于皮质BMG不具有软骨下骨的疏松孔状结构的缘故。于是，作者等用同种异体松质骨BMG负载软骨细胞构建组织工程软骨，结果表明软骨细胞形态及基质分泌更接近正常关节软骨［27，29-33］。

　　2.3  利用BMG和不同来源细胞种子构建组织工程化软骨

　　作者等首先分离、培养幼兔或人胚胎关节软骨细胞；或者采集、分离、纯化、培养兔BM-MSCs，并诱导分化成软骨前体细胞，同时制备皮质骨BMG和松质骨BMG，将培养的软骨细胞按一定密度［4×105/5 mm(直径)×1 mm(厚度)］种植在BMG上进行体外培养，于不同时间取材进行组织学观察及代谢功能检测。结果显示：种植于BMG的软骨细胞培养6 d可形成细胞单层；12 d可形成8-10层细胞的类软骨组织，细胞周围氨基多糖染色明显；18 d可形成12-15层细胞的类软骨组织，细胞周围氨基多糖染色更明显并出现胶原成分；培养到24 d直至42 d形成20层以上细胞的类软骨组织。所不同的是，培养在皮质骨BMG形成的类软骨组织围绕于BMG表面，类似于关节表面软骨；培养在松质骨BMG形成的类软骨组织，细胞分布于松质骨BMG网眼中，并与支架材料浑然一体。因此，软骨细胞种植于BMG体外培养1-6周，能获得具有分泌氨基多糖和胶原功能的类软骨组织。而且，使用皮质骨BMG形成的类软骨组织适合用于体外功能代谢和损伤实验研究；而使用松质骨BMG形成的类软骨组织适合用于移植修复骨软骨缺损(图1、图2)［27-33］。

　　3  组织工程化软骨的应用

　　近年来，作者等使用两种不同来源的种子细胞(包括异体胚胎源性软骨细胞在内的异体软骨细胞和自体骨髓间充质干细胞)和两种不同的BMG(皮质骨BMG和松质骨BMG)构建组织工程化软骨，并且进行了软骨损伤机理和软骨缺损修复的实验研究。这些实验研究不仅验证了构建组织工程软骨的可行性和有效性，还为其在实验室及临床上的应用提供了科学依据。

　　3.1  组织工程化软骨在软骨损伤机理研究中的应用

　　在软骨损伤机理的研究中，使用大骨节病可疑致病因子：T-2毒素、雪腐镰刀菌烯醇(nivalenol, NIV)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON)、丁烯酸内酯(butenolide, BUT)、串珠镰刀菌素(moniliformin, MON)和补充生理浓度硒，作用于体外单层培养的软骨细胞及再建的软骨组织，用于建立软骨变性坏死模型以及了解硒的作用。体外损伤实验结果显示：T-2、NIV、DON、BUT和MON作用于体外再建软骨组织后，在核酸水平、蛋白水平、细胞水平、组织水平和培养液均引起一系列改变，并且趋势相似。作者等观察到软骨细胞表面透明质酸受体CD44表达减少，基质中CD44表达增加，培养液中溶解的CD44表达增加，补硒后能减缓上述改变，却没有改变其变化趋势；毒素作用的体外再建软骨组织ECM中蛋白聚糖表位BC-13、3-B-3和2-B-6表达增加；软骨细胞和ECM中多聚蛋白聚糖酶、基质金属蛋白酶以及部分炎性因子表达增加。实验结果提示上述五种毒素均可以抑制软骨细胞分裂增殖，损伤软骨细胞，促进软骨细胞老化，引起再建软骨组织细胞坏死；并且能干扰软骨细胞表面黏附分子CD44表达；软骨蛋白聚糖过度降解，特殊表位表达增加，引起软骨ECM代谢紊乱；补硒能够部分拮抗毒素对软骨细胞分裂增殖的抑制作用，减轻毒素对软骨细胞的损伤 ［34-41］ 。这些研究结果与我们在大骨节病研究中的结果相一致［42］。

　　3.2  组织工程软骨在修复骨软骨缺损中的应用

　　组织工程方法修复关节软骨缺损突破了传统关节软骨修复理念，为关节软骨获得完全性组织结构重建和功能恢复提供了新的希望。将软骨细胞种植于松质骨BMG上体外培养12 d后形成的松质骨BMG-软骨细胞复合体置于同种异体兔膝关节骨软骨缺损处(直径4 mm)，全部实验兔子于术后10 d内恢复正常活动。术后BMG随时间延长逐渐被完全降解、吸收，BMG空隙中散在的软骨组织逐渐融合。术后24周骨软骨缺损处被软骨组织修复，与关节骨软骨缺损周围组织愈合良好。修复的软骨组织中，软骨细胞的排列在局部位置已类似于正常关节软骨组织；蛋白聚糖表达较正常关节软骨稍弱，胶原表型表达和正常关节软骨相一致。而单纯松质骨BMG植入的对照组则被纤维软骨不完全修复；不作任何植入的对照组以纤维组织部分充填。由此看出，松质骨BMG在体内与宿主组织有较好的组织相容性，并可被完全降解。结合体外实验结果，我们认为松质骨BMG是一种较好的、用于修复关节软骨缺损的软骨细胞支架材料；在缺损处使用胰蛋白酶还可促进修复组织与宿主缺损周围组织的愈合［43-45］。

　　而采用BM-MSCs诱导分化的软骨细胞所构建的松质骨BMG-软骨细胞复合体修复关节软骨缺损，实验结果与直接分离的软骨细胞所构建的相一致。“BM-MSCs-BMG”组织工程化软骨在术后1月时即以类透明软骨修复关节软骨缺损，同时重建了软骨下骨板；术后3月和6月可见修复缺损的软骨组织在细胞和纤维的排列方式上向正常软骨接近，在软骨下骨板完整的基础上厚度较正常关节软骨稍薄。BMG修复组在相应时限内虽重建了软骨下骨板，但缺损处始终未见到类软骨组织覆盖，局部区域可见到软骨下骨板裸露。骨软骨缺损模型自行修复组在相应时限内可见缺损区域凹陷，软骨下骨板未能完全修复，为薄层结缔组织覆盖。BMG修复组和缺损模型组在缺损边缘部位还可见到正常的软骨组织受压内陷。修复组织细胞内Ⅱ型胶原mRNA的原位杂交检测显示，“BM-MSCs-BMG”组的修复组织中有大量的细胞在其细胞浆中呈现出阳性染色标记，单纯BMG移植组和缺损模型组仅有少量细胞呈阳性染色。5-溴-2′-脱氧尿嘧啶的免疫组化检测表明，“BM-MSCs-BMG”组中修复组织的细胞大多数来源于移植的细胞。由此可以看出，自体软骨前体细胞(MSCs)复合同种异体BMG构建的组织工程化软骨生物相容性好，在移植后早期即以类软骨细胞表型重建关节骨软骨缺损［46］。

　　4  前景展望

　　目前，组织工程修复关节软骨缺损仍然处于动物实验阶段。美国FDA批准的临床治疗关节软骨缺损的标准技术是应用自体关节软骨细胞移植修复关节软骨缺损，而使用体外工程化软骨修复关节软骨缺损在临床应用中尚处于起步阶段。近年来，国内外不同学科专家在关节软骨组织工程各方面进行了大量的研究，取得了巨大成就，但仍然有许多问题有待解决。如种子细胞的选择以及体外培养体系不成熟；构建的支架材料不理想；生成的软骨细胞表型改变，胶原和蛋白聚糖存留很少；形成的软骨组织力学性能差，与宿主组织融合不好，后期容易退化。而且目前组织工程修复软骨损伤实验中的软骨缺损多由人为制作，没有体内代谢异常，而临床上，软骨损伤少数由外伤引起，大多数(OA、AR和KBD等)除局部软骨病变外，都有全身代谢异常。因此，在构建软骨修复动物模型时，需要考虑体内代谢异常对修复软骨的影响，应在骨性关节炎模型基础上模仿体内软骨损伤，再构建软骨组织工程修复模型，以更真实地评价组织工程修复软骨损伤的效果。而对于人类临床应用，除需解决以上述及的问题外，还需就如何建立组织工程软骨修复效果评价体系，保证组织工程组织的质量，以及移植物对机体的长期效果和安全性如何等问题予以深入的研究和解决。

　　近年来，软骨组织损伤的机制研究主要围绕软骨损伤后软骨基质大分子及相关调节因子在代谢中的作用，而很少研究软骨损伤修复过程中他们之间的相互关系。在生理情况下，软骨组织的代谢处于动态平衡中，参与维持这种动态平衡的生物大分子包括基质金属蛋白酶(matrix metalloproteases, MMPs)、多聚蛋白聚糖酶-1，2(a disintegrin and metalloprotease with thrombospondin type 4&5 motifs, ADAMT-4, 5)、白细胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、组织金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinase, TIMP)、α2巨球蛋白(α2 macroglobulin, α2M)、TGF-β等。它们在关节软骨中的表达和活性情况直接影响着ECM代谢。在正常情况下它们之间相互制约，相互作用，维持着ECM代谢的动态平衡。在病理状态下，TIMP和α2M活性下降，IL-1β、TNF-α、ADAMT-4，5和MMPs活性升高，导致ECM中胶原、蛋白聚糖等代谢平衡失常。目前，对软骨损伤过程中这些大分子之间的关系已经有了一定的了解，而在修复过程中这些生物大分子的表达状况如何，关系又是怎样的却知之甚少，为更好建立组织工程软骨修复效果评价体系，有必要对修复过程中的代谢机制进行深入研究。随着科学的发展，我们有理由相信，通过努力，软骨组织工程的研究不仅为临床上多见的软骨疾病和缺损的治疗开辟新的途径，而且对整个组织工程的进展会起到巨大的推动作用。

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