基因修饰小鼠应用于心脏研究的进展

作者：杜晓军    作者单位：实验心脏学研究室，Baker心脏研究所，墨尔本，澳大利亚

【摘要】  基因修饰(敲除、变异和过度表达)小鼠自90年代初应用于心脏学研究。近十余年来，利用这一类模型的研究发现对心血管领域所取得的重要进展有着突出的贡献，已经成为该领域里具有举足轻重地位的研究手段。目前，基因修饰小鼠模型的数量日益增多并已形成系统，有关的心脏表现型数据库日趋丰富，多种从整体到分子水平的表现型的研究手段已十分成熟。在今后的心脏研究中，小鼠模型有望对阐明疾病的分子机制和探索新的治疗途径起到很大的推动作用。

【关键词】  基因修饰小鼠 脏学 基因敲除 基因过度表达

　　From mouse to man, from gene to clinic: Progress in heart research　using genetically modified mouse models

　　Du Xiaojun

　　(Experimental Cardiology Laboratory, Baker Heart Research Institute, Melbourne, Australia)

　　ABSTRACT: Since the 1990s, models of genetically modified mice (gene knockout, mutation or transgene overexpression) have been increasingly used in heart research. The findings from this class of murine models have contributed significantly to a number of research breakthroughs achieved in the last 15 years. Currently, the number of genetically modified mouse strains has been increasing steadily. These models that targeted a family or a functionally relevant group of proteins have formed systemic tools for research use. The database of mouse cardiac phenotype has been established. Meanwhile, the research methodology and strategic approach exploring mouse cardiac phentypes at molecular to in vivo levels have been mature. It is expected that the use of this class of genetically targeted mouse models will become increasingly important in future research.

　　KEY WORDS: genetically modified mouse; cardiology; gene knockout; gene overexpression

　　在破译了人类DNA编码序列之后，科研人员面临的更艰巨的任务是探讨基因在生命健康及疾病发生发展过程中的作用，从而寻求疾病诊治的新途径。目前开展这方面研究的重要手段之一是已广泛应用的基因修饰小鼠。近十余年的研究证实，这一类模型的应用对生物医学领域新近取得的重要进展有着突出的贡献。因此，Rario Capecchi，Martin Evans和Oliver Smithies荣获了2007年度诺贝尔生理和医学奖，以表彰他们在奠定应用小鼠胚胎干细胞进行特定基因干预原理方面的贡献。
   
　　可以用于心脏学研究的基因修饰小鼠的品系估计已达数千种。随着数量的积累，这一类小鼠模型已形成系统。由此获得的科研发现对认识某一蛋白家族或相关分子在心脏中的作用非常重要。例如，肾上腺素能受体9种亚型的敲除、变异或过度表达的小鼠均有报道[1]。又如，众多的参与心肌肥大信号转导的信号分子基因的敲除、变异或过度表达的小鼠模型均已建立并广泛应用[2]。同样，针对位于细胞膜或内质网钙库钙通道、离子交换体、钙ATP酶等多种钙信号调控蛋白，目前已有20余种基因敲除、变异或过度表达小鼠模型[3]。

　　1  基因修饰小鼠的种类
   
　　应用胚胎干细胞单个基因干预技术和不同启动子的选择，目前可以制造单个基因敲除、变异基因表达、基因过度表达的小鼠品系[4]。在敲除某一基因的基础上敲入(knockin)另一基因的模型可以用来研究一种基因的功能能否被另一相关(如用人的基因替换小鼠基因)或变异基因所替代。基因敲入方法也可以导入某种报告基因(reporter)。两种以上基因的干预则可以通过小鼠品系间杂交而得到(表1，图1)。目前的趋势是制造可调控性和器官或细胞特异的基因干预小鼠模型，从而避免其他非特异性的影响或影响小鼠胚胎发育而无法得到成年动物[4]。

　   表1  基因修饰小鼠的种类（略）

　　Table 1  Types of genetically modified mouse models

　　图1  不同小鼠品系间杂交(crossbreeding)可供研究基因(蛋白质)之间的相互作用以及心脏病的基因治疗。例如在探讨基因治疗心力衰竭方面，品系间杂交方法可以研究一种提高心肌收缩性的基因干预能否纠正某一种基因干预所引起的心肌病和心力衰竭（略）

　　Fig.1 Crossbreeding of strains of mice wtih specific gene targeting allows for investigating genegene (or proteinprotein) interactions or explorating gene therapy of heart disease, such as heart failure. A: Depicted are two strains of genetically modified mice with cardiac phenotypes of either cardiomyopathy and heart failure (indicated by yellow colour) or a markedly enhanced myocardial contractility (indicated by red colour). B: Crossbreeding is useful in determining whether the heart failure phenotype seen in the cardiomyopathy strain can be reversed by the specific genetargeting leading to an enhanced inotropy (indicated by blue colour)

　　2  小鼠心脏表现型的研究手段
   
　　小鼠心脏重约0.1g，左心室容量约40μL，每博心输出量为20-25μL，心率则高达600次/min。因此，在准确定量小鼠心脏形态和功能变化方面对研究仪器的要求很高。近十余年来，多个大公司在科研仪器方面的投入对小鼠心脏学研究起到了很大的推动作用。在心脏影像学方面，多个公司的超声心动影像系统目前均可以达到相当好的分辨率(0.05-0.1mm)(图2A)。彩色血流或组织多普勒、两维Strain rate、心脏超声造影等均普遍或开始应用于科研中。VisulSonic公司的高分辨率超声系统可供观测胚胎小鼠心脏形态及功能状况。核磁共振成像(MRI)的应用也时有报道。Millar导管公司的超微高保真度压力和压力/容积导管以及心脏内心电图电极导管也是开展研究的必具设备(图2A)。其他常用的仪器还包括D.S.I.公司的监测血压或心电的Telemetry系统，Harvard Apparatus公司的微型呼吸机等。
   
　　另一方面，近十几年对整体小鼠心脏表现型的研究表明，在应激或疾病情况下研究小鼠心脏表现型对于阐明基因在疾病发生和发展中的作用至关重要[5]。常用的小鼠心脏疾病模型包括主动脉缩窄 (压力超负荷)、容量超负荷、心肌缺血/再灌注、心肌梗死等(图2B)[5]。自从开展小鼠心脏研究以来，业已积累了丰富的相关数据库。研究所必需的大量试剂如抗体、检测药盒、DNA array芯片等均有商品化供应。这些均为今后的研究奠定了基础。

　　3  应用基因修饰小鼠模型所取得的重要研究进展
   
　　与肿瘤、免疫、炎症等领域一样，基因修饰小鼠的应用与近十几年来在心脏学研究领域中所取得的重要进展密切有关(图3)。现分以下几个方面简述。

　　图2  A：应用心脏超声影像学(左)或压力/容积心导管(右)确定小鼠心脏形态和功能。图示小鼠左心室(LV)短轴和长轴二维影像；B：显微外科手术方法造成冠状动脉结扎(左)或主动脉缩窄(右)（略）

　　Fig.2 A: Determination of cardiac toporgraphy and function of mice by echocardiography (Left) or by pressure/volume catheter (right). Images are short and longaxis views of the left ventricle (LV) of a mouse. B: Ligation of the coronary artery (left) or constriction of the aortic arch (right) in the mouse by openchest surgery. a: aorta; r.i.: right innominate artery; l.m.: left main carotid artery

　　图3  目前用小鼠模型进行心脏研究的基本途径是应用综合的研究手段在不同的层次去发现小鼠的心脏表现型，包括在病理情况下研究心脏形态和功能改变。这些表现型对于理解人类心脏病的分子机制、新的治疗靶分子和治疗途径具有重要的价值（略）

Fig.3 Using genetically modified mice, researchers have adopted an integrated physiological approach to explore phenotypes that may bear key information on the regulation of physiology, pathogenesis of diseases and potential therapeutic targets

　　3.1  动脉粥样硬化的机制和模型  动脉粥样硬化的病因涉及多种基因和环境因素，因此较好地模拟临床病理特征的动物模型是研究发病机制和探讨有效治疗方案的关键。啮齿类动物的高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)的比值(HDL/LDL)远远高于人类，故不易诱发动脉粥样硬化病变。基于干扰脂蛋白代谢而建立的数种基因修饰小鼠在老龄或某些环境因素，例如高脂饮食、高血压、血管内皮损伤等的影响下，可以发生与人类相似的动脉粥样硬化病变。这些模型包括脂蛋白E基因敲除 (ApoE -/-)、低密度脂蛋白受体敲除(LDLR-/-)和表达变异的ApoE基因(E3L)[6]。应用这些小鼠模型进行的研究极大地促进了对动脉粥样硬化病变病因的认识和实验性治疗的探讨，已成为最常选用的动物模型。

　　3.2  心脏发生学及先天性心脏病的分子机制  应用基因敲除小鼠研究心脏胚胎发生的分子机制在近年里有了突破性进展。现已确定若干基因在心脏发生的各个阶段起到关键作用。例如，NKx2.5基因缺失小鼠发生心房心室间隔缺损和传导系统障碍[7]。又如组织转化因子β(TGFβ)影响心脏瓣膜的形成，而心肌的发生则受到多个基因的影响，包括ErbB、EF2、SRF、GATA和myocardin等[78]。新近的研究表明，敲除微小RNA1.2(miR1.2)可能通过抑制心脏发生中关键基因之一Hand的mRNA、蛋白的转录、翻译而干扰心房间隔的形成[9]。这些研究为深入了解心脏发生的分子机制打下了方法学基础，也为人类先天性心脏病的分子发病学和基因诊断提供了重要的实验依据。

　　3.3  心肌病的分子机制  心肌病的发生与肌节的结构蛋白、收缩蛋白或收缩调节蛋白的基因变异密切有关。目前已有上百种有关的基因变异或缺失小鼠模型的报道。心脏表现型研究证明其中绝大多数品系的小鼠发生各种类型的心肌病[78]，而且许多小鼠心肌病的表现型与人类相关基因变异所致的心肌病相似。例如，α肌凝蛋白重链(αMHC)的变异导致肥厚型心肌病，而mLIM基因敲除小鼠发生扩张型心肌病[10]。目前利用小鼠复制相应基因变异已成为确定人类心肌病基因发病机制的重要研究手段。
   
　　妊娠心肌病的病死率很高，其病因一直不清楚。新近的研究取得了突破性进展[11]。妊娠期间心肌发生生理性肥大并伴有毛细血管增生。心肌特异性敲除STAT3的雌性小鼠妊娠时心肌肥大但不伴有毛细血管增生，证明了STAT3在介导血管增生中的关键作用。STAT3的另一保护性作用是抑制氧化应激，而氧化应激可以诱导某些基因的表达，如Cathepsin D。Cathepsin D降解在妊娠后期至泌乳期大量分泌的泌乳素，生成16ku的片段。该片段可抑制微血管的生成，因而STAT3敲除小鼠发生妊娠心肌病[11]。进一步的临床研究证实了在小鼠模型上观测到的这些分子异常，并验证了应用药物抑制泌乳素的分泌，可以有效地治疗妊娠心肌病[11]。

　　3.4  心肌肥大的分子信号转导  生理性和病理性心肌肥大的分子机制是应用基因修饰小鼠的重要研究方面。应用表达组成型活化(constitutively active)和显性抑制(dominant negative)磷酸肌醇3激酶(PI3K)的基因修饰小鼠的研究证明，胰岛素生长激素(IGF1)/PI3K介导生理性心肌肥大[8,12]，而多种信号通路通过钙/calcineurin或Gq蛋白/蛋白激酶C(PKC)等导致病理性心肌肥大。Olson的研究组应用基因修饰小鼠模型证实的Calcineurin通路是这一领域的突破性进展[13]。
   
　　应用基因修饰小鼠模型的一些发现使我们对心肌肥大有了全新的认识。例如，以往认为α1A肾上腺素能受体(α1AAR)激活是导致心肌肥大的重要机制之一。而新近的研究发现，过度表达α1AAR本身并不引起心肌肥大[1]，也不加重病理情况下的心肌肥大[14]。另一重要发现是在慢性压力超负荷情况下，多种基因修饰小鼠心肌肥大程度明显轻于对照动物，而心室功能可以保持在代偿状态[1517]。这一发现对心肌肥大是长期压力超负荷状况下必须的代偿机制的传统观点提出了质疑，并提示抑制或逆转心肌肥大可能成为治疗心脏病的新目标。

　  3.5  心律失常的分子机制  目前，基因修饰小鼠已成为心脏电生理的主要哺乳类动物模型，相应的研究发现对理解心律失常发生及维持的基因和分子机制，尤其是离子通道病(channelopathy)概念的提出有着重要的贡献。离子通道病涉及细胞膜钾、钠或钙通道蛋白的变异。表达某些细胞膜离子通道蛋白的小鼠表现出人类相似的心脏电生理乃至心肌显微结构方面的异常，例如长或短QT综合征(LQTS，SQTS)或Brugada综合征[18]。许多心肌病小鼠也表现出各种类型的心律失常和心性猝死，为这方面的研究提供了有价值的模型。
   
　　心房纤颤是临床最为常见的心律失常，其治疗方案和疗效有待提高。然而对心房纤颤的分子病因一直不清楚。近年来已有若干个小鼠心房纤颤模型问世，基因修饰包括心肌特异性过度表达TGFβ、RhoA、肿瘤坏死因子α(TNFα)或敲除KCNE1[1920]。我们新近的品系间杂交研究发现，降低心肌病小鼠心肌PI3K的活性可以加重心房扩大和心肌纤维化病变，并诱发心房纤颤[21]。

　　3.6  细胞内钙的调控与心脏病的联系  在心肌舒张时相，衰竭心肌发生肌浆网内储存的钙经由Ryanodin受体(RyR)控制的钙通道而外漏，造成舒张期细胞内钙水平升高，由此导致心肌舒张不全和心律失常。利用一系列的小鼠模型，Marks的研究组最近证明，几种RyR结合蛋白起到了稳定RyR钙通道的作用。在心力衰竭情况下，这些蛋白质尤其是FK506结合蛋白(FKBP12.6)被过度磷酸化而与RyR分离，从而导致RyR通道功能异常进而引起钙库内钙外溢[22]。循此发现，目前已开发出数种RyR钙通道稳定剂，经实验研究证实具有改善心功能和抗心律失常的作用。

　　3.7  小鼠模型在心脏病基因或细胞治疗研究方面的应用  在心脏病基因或细胞治疗研究领域，小鼠模型的应用首先是提供了一系列的心脏疾病和实验工具。心力衰竭的突出问题是心肌收缩力减弱。利用基因修饰小鼠模型的研究业已确认，十余种基因干预可以长期提高基础状态下的心肌收缩性(表2)。例如过度表达肾上腺素能受体(α1A、β1、β2AR)等均可显著提高心肌收缩性[1]。然而进一步的研究发现其中一些品系的小鼠由于特定基因表达倍数过高或随着年龄增加而出现心肌病理损害和心肌病，提示基因干预(过度表达)具有量效关系(表2)[1,23]。有数种基因干预小鼠则无明显心脏病变而正性肌力作用长期保持，例如敲除受磷蛋白(phospholamban)，过度表达5型腺甘环化酶或低倍数过度表达β2AR(<100倍)或α1AAR(<80倍)等。应用品系杂交的方法证明，敲除受磷蛋白可以逆转由于mLIM敲除或β1AR过度表达所引起的扩张型心肌病[10,24]。
   
　　松弛素(relaxin)是一生殖生理肽类激素。我们于2003年报导松弛素基因敲除小鼠随着年龄增加而出现心肌纤维化并伴有心室舒张功能异常[25]。而后的研究发现应用人松弛素进行治疗或利用腺病毒介导的松弛素基因转染均可以逆转动物心肌纤维化病变。
   
　　心脏病细胞治疗设想的提出令人鼓舞。然而，目前临床小规模实验疗效有限，尚有大量关键的基础问题还待解决，例如移植的干细胞存活率不理想、分化程度低、与生存的心肌之间的功能匹配不佳等。目前多种小鼠模型是该领域研究的必不可少的工具，例如有免疫缺陷而对植入干细胞没有排斥反应的SCID小鼠，可供监测植入干细胞的EGFP(定位于胞浆)或βGal(定位于胞核)的转基因小鼠等。应用基因修饰小鼠的研究还证明了一些与移植干细胞存活和向心肌细胞分化的重要因子，如胰岛素生长因子、AKT等。

　　表2  目前证实具有正性肌力表现型的一些基因修饰小鼠品系。其中一些品系发生心肌病而提示基因治疗“副作用”的可能（略）

　　Table 2  Strains of genetically modified mice with identified cardiac hyperinotropy phenotype. Some of strians also develop with aging cardiomyopathy indicating sideeffect of gene overexpression

4  研究展望
   
　　新一代小鼠模型(即器官或细胞特异性，可调节性敲除或过度表达)将会越来越多地采用，从而避免小鼠胚胎期死亡或一些非特异的心脏表现型。可以预测，基因修饰小鼠的应用在今后会日益广泛。这一类模型已经并将更多地用于心脏基因表达和蛋白转录调控方面的研究，包括表观遗传学(epigenetics)、微小RNA(micro RNA)和siRNA[4,9,26]。
   
　　在阐明新的治疗概念(proofofconcept)方面，对基本的心脏病理生理机制，例如心律失常、心肌纤维化、心肌肥大、心肌病等的研究将会更多地应用小鼠模型，而这些研究将会导致一些重要的全新认识。一般认为小鼠模型上的发现在推广到临床应用之前需要在大的动物模型(translational models)上予以进一步验证。然而已有证据表明，在某些情况下，实现科研发现从“小鼠到人”的直接过渡是可能的，例如前面述及的产后心肌病病因和临床治疗方案的阐明[11]。
   
　　目前已认识到，小鼠基因背景(即品系)对表现型有重要的影响[27]，这对表现型的解释以及不同小鼠品系的基因修饰模型之间的比较造成一定困难。然而这一特征为今后研究基因背景对某一特定基因功能的影响提供了重要的线索和研究手段，值得应用基因组学的研究手段进行探讨。
   
　　为了加快突破性的科研发现以及从基础到临床或从小鼠到人之间科研成果的转化，需要基础科研人员与临床医生有更多的交流与合作。这不仅为基础研究不断提供新的线索和思路，也有利于加强临床人员的科研意识和提高疾病诊断治疗的水平。

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